肝臟缺血再灌注時MIP-1α和HIF-1α表達的時空相關性分析和意義探討.pdf

1、肝臟是機體最大的實質性器官,接受25％的心臟輸出血液,具有門靜脈和肝動脈雙重血供,供血量非常豐富。自1908年Pringle報道在肝切除術中應用控制肝十二指腸韌帶的止血方法以來,肝臟對缺血耐受的時限及肝內不同細胞群體對缺氧的耐受性差別受到普遍關注,至今仍有較大爭論。肝臟缺血再灌注常見于創(chuàng)傷、休克、及多種復雜肝臟手術,特別是用Pringle手法阻斷肝血流切除大的肝內病灶和肝移植手術。在肝臟血供恢復后,肝臟受到進一步的“打擊”,發(fā)生缺血再灌

2、注損傷(hepatic ischemical reperfusion injury,HIRI)。HIRI發(fā)生機制復雜,炎癥反應被認為是HIRI的實質。肝臟缺血再灌注時肝細胞發(fā)生代謝功能障礙,各種炎性因子生成,大量氧自由基生成,同時門靜脈系統(tǒng)淤血,腸粘膜屏障功能障礙。再灌注后含有毒素的門靜脈血流入肝產生損害作用,激活免疫細胞分泌大量炎性介質,炎性介質反向促進免疫細胞的激活。炎性介質和缺氧狀態(tài)作用于肝臟細胞并可能產生復雜的病理生理過程。本文

3、主要通過觀察肝缺血再灌注不同時限大鼠肝臟和小腸的病理形態(tài)學變化及檢測肝臟及小腸標本中的巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflamationg protein-1α,MIP-1α)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達變化,探討其相關性,并對二者在肝缺血再灌注損傷發(fā)生中的意義及相關機制進行探討。
　　 目的
　　 通過建立SD大鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型,

4、觀察大鼠肝臟缺血45min后再灌注不同時限肝臟及小腸的病理形態(tài)學變化,免疫組織化學方法檢測MIP-1α和HIF-1α在肝臟及小腸組織中的表達情況,觀察MIP-1α和HIF-1α在HIRI時表達的時空分布特點,進一步了解炎性損傷及氧化應激在肝臟缺血及再灌注時對肝臟缺血所致的消化道淤血性損傷以及后者對肝臟的再灌注損傷時發(fā)揮的作用。
　　 方法
　　 1.實驗分組成年健康SD雄性大鼠55只,隨機分為三組:正常組(n=5)、缺血

5、再灌注組(n=25)、假手術組(n=25),缺血再灌注組和假手術組又根據缺血再灌注后不同時限點(0h、3h、12h、24h、72 h)隨機分為5個亞組,每組5只。
　　 2.動物模型建立術前禁食12 h,自由飲水；正常組:處死后進腹直接取材。缺血再灌注組:術前處理同正常組,行腹腔內注射麻醉(3％戊巴比妥鈉40mg/kg),取上腹3 cm正中切口,進入腹腔游離并用無損傷動脈鉗夾閉肝蒂45min后放開動脈鉗,再灌注0h組進腹后直接取

6、材,其余大鼠切口給予縫合,繼續(xù)飼養(yǎng),于各再灌注時限點(3h、12h、24h、72h)取材。假手術組:術前處理及麻醉方法同缺血再灌注組,進入腹腔后僅游離肝蒂但不阻斷,取材方法及時限點同缺血再灌注組。
　　 3.觀察指標與方法①光鏡下病理變化觀察:10％福爾馬林固定大鼠肝臟及小腸標本(上段空腸組織長約5cm),梯度酒精脫水,石蠟包埋后,常規(guī)連續(xù)切片。切片行HE常規(guī)染色。②超微病理變化觀察:肝臟及小腸電鏡標本取材后放于3％戊二醛中固定

7、20min修塊取材,SPURR低粘度包埋劑浸透包埋聚合。組織標本行掃描電鏡觀察。③MIP-1 α和HIF-1 α表達檢測--免疫組織化學SABC法:檢測試劑盒購于武漢博士德生物制品公司。MIP-1 α免疫組化結果以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達。HIF-1α陽性判斷標準為胞質棕黃色顆粒沉著,少量核染色。每張切片取10個200倍視野運用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)行免疫組化染色陽性反應產物定量分析,記錄陽性單位(pos

8、itiveunit,PU),并取其平均值,以PU值表示陽性產物表達的多少。
　　 4.統(tǒng)計處理 所有計量數據均以平均值±標準差((x)±s)表示,計算基本統(tǒng)計量,所有實驗組用析因設計的方差分析比較主效應和交互效應后,多重比較采取LSD法進行檢驗,P<0.05表示結果具有統(tǒng)計學意義。雙變量相關分析(Bivariate)兩變量間相關性。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,P<0.05代表有統(tǒng)計學意義。
　　 結論

9、>　　 各種因為引起的一定程度的肝臟缺血當再灌注期血供恢復后,肝臟細胞功能代謝障礙及組織結構破壞進一步加重,在這一過程中大量炎性細胞浸潤、激活釋放炎性介質參與組織損傷。HIF-1α在多種組織缺氧應激狀態(tài)下表達,并通過調節(jié)其他細胞分子的表達而對組織細胞發(fā)揮作用。MIP-1α屬于CC趨化因子一員,肝臟Kuffer細胞可以分泌MIP-1α并引起炎性細胞的聚集,促進組織炎性損傷。
　　 HIF-1α與目的基因結合后,調節(jié)相關基因的表達

10、,使細胞對缺氧的適應能力增強,其表達增強可能與多種疾病的細胞凋亡損傷有關。本實驗中,在正常組及假手術組大鼠肝臟及小腸組織中HIF-1α表達細微。缺血再灌注后,HIF-1α在肝臟及小腸組織均有明顯表達。HIF-1α的首先表達部位可能與肝竇間隙、微膽管、中央靜脈區(qū)組織細胞血供較差,氧濃度較低,阻斷肝血流后缺血缺氧性損傷最先累及該區(qū)域有關。而在小腸組織中,腸粘膜細胞微絨毛處的血供最差,最易引起缺血缺氧性損害,故成為HIF-1α最先表達的部位。

11、
　　 HIF-1α和MIP-1α表達的正相關性表明,HIF-1α作為轉錄調節(jié)因子可能通過促進MIP-1α等趨化因子的表達從而增強炎癥反應過程,HIF-1α可能是MIP-1α表達的重要調節(jié)因子。有研究表明HIF-1α可使細胞自發(fā)激活上調炎性蛋白表達而增強上皮炎性反應,并參與了骨髓細胞的增殖分化過程。MIP-1α等趨化因子的表達增強使炎性細胞向炎性損傷部位聚集,炎性細胞與內皮細胞粘附導致微血管出現無復流現象,進一步加重組織缺氧。H

12、IF-1α與MIP-1α在小腸組織與肝臟組織中表達峰值時相及表達恢復情況的差異因為,考慮可能因為門靜脈系統(tǒng)淤血造成胃腸道循環(huán)系統(tǒng)微小血栓形成,在肝門開放后,胃腸道繼續(xù)存在部分缺血缺氧情況,從而影響胃腸道炎性損傷的恢復所致。
　　 本研究結果表明肝臟的缺血不僅可造成肝臟實質性及非實質性細胞的自身損傷,而且可造成消化道的損傷。在再灌注初期,肝臟血流再通后各種途徑產生的氧自由基對肝細胞損傷起主要作用。在小腸組織中,隨著肝門阻斷時間延長

13、,門靜脈系統(tǒng)淤血程度的增加造成消化道缺氧:小腸組織有氧代謝障礙產生的活性氧簇使小腸組織受損,活性氧簇通過脂質過氧化、促進中性粒細胞聚集及抑制線粒體功能加速細胞能量的消耗等作用導致小腸粘膜細胞損傷。此外,消化道的淤血性損傷也可能是造成肝臟復流后再灌注損傷的重要因為之一,因為消化道產生的氧自由基及各種炎性介質可隨著再灌注后的門靜脈血流進入肝臟,進而加重肝臟的損傷；二者互為因果,造成肝臟的缺血再灌注損傷和機體整體的氧化應激反應。