青藤堿對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠HPA軸、外周血單個(gè)核細(xì)胞皮質(zhì)酮受體及滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)的影響.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以慢性、對稱性、多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，最終可影響關(guān)節(jié)功能甚至致殘。其侵犯的靶器官主要是關(guān)節(jié)滑膜。該病的病因尚不完全明確。近年來，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)途徑在RA的發(fā)病機(jī)制中越來越受到重視。業(yè)已證實(shí)，該系統(tǒng)對RA發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)實(shí)現(xiàn)的。H

2、PA軸在抑制RA炎癥反應(yīng)和免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GCR)不僅是糖皮質(zhì)激。素(glucocorticoid，GC)或皮質(zhì)醇(大鼠體內(nèi)為皮質(zhì)酮)免疫信號的介導(dǎo)者，其本身也是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的有效工具。其與靶細(xì)胞結(jié)合量的變化可能與RA的發(fā)生、發(fā)展有一定的內(nèi)在聯(lián)系。青藤堿(sinomenine)可能是通過HPA軸，增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，起到非特異性抗炎作用。然而，對于青藤堿通

3、過HPA軸治療RA的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究目前開展的很少。本課題以佐劑關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induccd arthritis，AA)大鼠模型為基礎(chǔ)，觀察研究青藤堿對其關(guān)節(jié)炎癥程度，血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin release hormone，CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質(zhì)。酮，滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)以及外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)的影

4、響，探討HPA軸在RA發(fā)病機(jī)制中的作用以及青藤堿的治療效果。方法：(1)將125只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組25只。I組：正常對照組，II組：單純造模組，III組：造模+低劑量青藤堿治療組，Ⅳ組：造模+中劑量青藤堿治療組，V組：造模+高劑量青藤堿治療組。第II～V組每只大鼠多點(diǎn)皮內(nèi)注射完全性弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)制作AA大鼠模型。造模成功率依據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritisi

5、ndex，AI)評定。各組又根據(jù)造模后不同時(shí)間點(diǎn)(7、14、28、35及42天)各分為5個(gè)亞組。(2)造模后第14天開始，Ⅲ組、Ⅳ組和V組分別給予青藤堿注射液15mg/kg·d，30mg/kg·d，60mg/kg·d肌肉注射治療。(3)測定不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的踝關(guān)節(jié)下足墊厚度，并進(jìn)行AI評分。(4)應(yīng)用放射免疫分析法檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血漿CRH、ACTH及皮質(zhì)酮濃度。(5)應(yīng)用放射配體結(jié)合分析法檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)情況。(

6、6)對不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠滑膜組織進(jìn)行CRH、ACTH的免疫組織化學(xué)染色，采用真彩病理圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。(7)觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變，并進(jìn)行病理積分評定。(8)應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：(1)AI：第II組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)AI均高于第I組(P＜0.01)，高峰出現(xiàn)在造模后28天；35～42天Ⅳ組、V組AI低于II組(P＜0.05)，III組與II組之間AI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.0

7、5)；III組、Ⅳ組、V組之間各時(shí)間點(diǎn)AI值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(2)踝關(guān)節(jié)下足墊厚度：第II～V組大鼠足墊厚度均于造模后14天開始增厚，21～28天達(dá)峰值，之后逐漸下降，42天足墊厚度仍高于正常對照組值(P＜0.01)；V組于28天足墊厚度低于II組(P＜0.05)，較Ⅳ組提前14天，即Ⅳ組第42天足墊厚度低于II組(P＜0.01)，III組各時(shí)間點(diǎn)足墊厚度與II組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；V組于28天足墊厚度低于I

8、II組(P＜0.05)，較Ⅳ組提前7天，V組于35天足墊厚度低于Ⅳ組(P＜0.05)。(3)血漿CRH濃度：與I組比較，II～V組在造模后35天血漿CRH濃度水平顯著下降(P＜0.01)，至造模后42天雖III～V組有所上升(P＜0.05)，但I(xiàn)I～V組仍低于正常對照組值(P＜0.05)；與II組比較，Ⅳ～V組血漿CRH濃度在35天以后明顯升高(P＜0.05)，III組在42天時(shí)高于II組(P＜0.01)，提示中劑量和高劑量在35天時(shí)顯

9、示出治療效果，可提高AA大鼠血漿CRH水平，較低劑量提前7天；35～42天時(shí)，IV組血漿.CRH濃度高于III組，V組高于IV組且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，提示高劑量治療效果優(yōu)于中劑量，而中劑量又優(yōu)于低劑量。(4)血漿ACTH濃度：與I組比較，II～V組在造模后14天血漿ACTH濃度水平顯著上升(P＜0.01)，28天達(dá)到高峰，后雖III～V組有所下降(P＜0.05)，但至造模后42天II～V組仍高于正常對照組值(P＜0.01)

10、；與II組比較，V組血漿ACTH濃度在35天以后降低(P＜0.05)，Ⅳ組在42天低于II組(P＜0.01)，提示高劑量組在35天時(shí)顯示出治療效果，可降低AA大鼠血漿ACTH水平，較中劑量組提前7天，低劑量組在觀察時(shí)間內(nèi)未顯示出治療效果；35天時(shí)，V組血漿ACTH濃度低于III組(P＜0.05)，42天時(shí)，Ⅳ組血漿ACTH濃度低于III組，V組低于Ⅳ組(P＜0.05)，提示高劑量組起效最早，且治療效果最佳。(5)血漿皮質(zhì)酮濃度：與I組比

11、較，II～V組在造模后14天血漿皮質(zhì)酮濃度水平顯著下降(P＜0.01)，28天降至最低，后雖Ⅳ～V組血漿皮質(zhì)酮濃度有所上升(P＜0.05)，但至造模后42天Ⅱ～Ⅴ組血漿皮質(zhì)酮水平仍低于正常對照組值(P＜0.01)；與Ⅱ組比較，Ⅳ～Ⅴ組皮質(zhì)酮濃度在35天以后高于Ⅱ組(P＜0.05)，而Ⅲ組在各時(shí)間點(diǎn)血漿皮質(zhì)酮濃度與Ⅱ組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。提示中、高劑量組在35天時(shí)顯示出治療效果，可提高AA大鼠血漿皮質(zhì)酮水平，而低劑量組在觀察

12、時(shí)間內(nèi)未顯示出治療效果；35天時(shí)，Ⅴ組血漿皮質(zhì)酮濃度高于Ⅲ組、Ⅳ組(P＜0.05)，Ⅲ組與Ⅳ組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，42天時(shí)，Ⅳ組血漿皮質(zhì)酮濃度高于Ⅲ組(P＜0.05)，Ⅴ組高于Ⅳ組(P＜0.01)，以上提示高劑量組治療效果優(yōu)于中劑量組。(6)外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)：與正常對照組比較，AA模型組外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)下降(P＜0.01)，經(jīng)高劑量青藤堿治療28天后GCR表達(dá)較模型組上升(P＜0.05)，但仍低于正常水

13、平(P＜0.05)，提示青藤堿能夠提高AA大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)。(7)滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)：與Ⅰ組比較，Ⅱ～Ⅴ組滑膜組織CRH、ACTH的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P＜0.01)，Ⅱ組表達(dá)最強(qiáng)，峰值出現(xiàn)于造模后28天，后逐漸下降；與Ⅱ組比較，3個(gè)治療組都能夠降低AA大鼠滑膜組織CRH、ACTH的表達(dá)量(P＜0.01)，其中高劑量青藤堿在造模后28天就顯示出此作用，中劑量于造模后35天起效，低劑量起效最晚，為造模后4

14、2天；28天時(shí)Ⅴ組滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)低于Ⅲ組和Ⅳ組(P＜0.01)，35～42天時(shí)，Ⅴ組低于Ⅳ組、Ⅳ組低于Ⅲ組(P＜0.01)，提示高劑量治療效果優(yōu)于中劑量，而中劑量又優(yōu)于低劑量。(8)踝關(guān)節(jié)病理積分：造模后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Ⅱ組病理積分均顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，其中28～42天最高；3種劑量的青藤堿均能降低病理積分，其中高劑量作用最強(qiáng)，35～42天V組病理積分較III組、Ⅳ組低(P＜0.05)。(9)相關(guān)性分析：踝關(guān)節(jié)下足墊

15、厚度分別與AI、血漿ACTH濃度、滑膜組織CRH、ACTI：{表達(dá)量之間呈正相關(guān)，P＜0.01；而與血漿CRH、皮質(zhì)酮濃度之間分別呈負(fù)相關(guān)，P＜0.01；血漿ACTH濃度分別與滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)量之間呈正相關(guān)，P＜0.01；滑膜組織CRH與ACTH表達(dá)量之間呈正相關(guān)，P＜0.0 1。結(jié)論：(1)AI與踝關(guān)節(jié)下足墊厚度呈正相關(guān)，均能反映關(guān)節(jié)腫脹情況，后者更為精確、客觀。(2)造模后AA大鼠血漿CRH降低，ACTH升高，皮質(zhì)酮濃度

16、降低，提示HPA軸存在功能缺陷，而且可能同時(shí)發(fā)生在下丘腦和腎上腺水平。經(jīng)青藤堿治療后各項(xiàng)指標(biāo)有所恢復(fù)，但不能至正常水平。青藤堿治療效果與劑量、時(shí)間相關(guān)。劑量越大，時(shí)間越長，治療效果越好。(3)造模后AA大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞GCR表達(dá)降低，經(jīng)高劑量青藤堿治療后有所恢復(fù)，但不能至正常水平。提示AA發(fā)病過程中GCR表達(dá)降低，且青藤堿具有一定的治療作用。(4)造模后從大鼠滑膜組織CRH、ACTH表達(dá)顯著高于正常對照組，經(jīng)青藤堿注射液治療后有所恢