重組人內(nèi)抑素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞周期的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察重組人內(nèi)抑素(recombinant human endostatin，rh-Endostatin)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)周期及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其抑NAAFLS增殖的細(xì)胞與分子機(jī)制，為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)藥物治療及尋找治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 方法:①AA大鼠模型的制備：雄性SD大鼠，6-7周齡，體重160-170g，后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，CFA)0.1ml致炎。②動(dòng)物分組及給藥：造模后d10，將AA誘導(dǎo)的大鼠分為AA組、rh-Endostatin組和甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)組，其中rh-Endostatin組于造模后d 10開(kāi)始，連續(xù)7d腹部皮下注射給藥(2.5mg·kg-1·d-1)，MT

3、X組于造模后d10和d16腹部皮下注射給藥(1.0mg·kg-1·d-1)，d26處死大鼠用于后繼實(shí)驗(yàn)。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-FQ-PCR)檢測(cè)各組大鼠滑膜組織中周期相關(guān)基因p53、p21、周期蛋白依賴性激酶-4(cyclin-dependentkinase4，CDK)、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)和增殖細(xì)胞核抗原(preliferation cell nuclear antigen，PCNA)mRNA的表達(dá)。④Wester

4、n blot法檢測(cè)各組大鼠滑膜組織中PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)。⑤組織塊移植法培養(yǎng)細(xì)胞及鑒定FLS：取正常組和AA組大鼠滑膜組織作細(xì)胞培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀(flomcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)傳2代的AA組大鼠滑膜細(xì)胞中血管細(xì)胞粘著分子(vascularcell　adhesion　molecule-1，VCAM-1)的表達(dá)。@FCM檢測(cè)各組FLS的周期：將AAFLS均分為AA組、rh-Endostatin(50 μg·ml-1

5、)組和MTX(1μg·ml-1)組，加藥培養(yǎng)48h后和正常組FLS同時(shí)上機(jī)檢測(cè)。 結(jié)果:①大鼠致炎后d10即可出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為四肢足爪腫脹，耳、尾出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)和紅斑并伴有體重減輕。造模后d 26，光鏡下可見(jiàn)其滑膜組織水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞過(guò)度增殖等。②與AA組相比，rh-Endostatin組大鼠滑膜組織rbp53和p21mRNA表達(dá)水平降低，CDK4 mRNA的表達(dá)水平顯著增高。rh-Endostatin

6、組滑膜組織中CyclinD1和PCNAmRNA及其蛋白的表達(dá)量均低于AA組，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。③傳2代培養(yǎng)的AA大鼠滑膜細(xì)胞經(jīng)FCM鑒定，VCAM-1表達(dá)率為94.2％。④rh-Endostatin使AA FLS細(xì)胞周期G0/G1期的比例由10％上升到74.1％，S期和G2/M期分別由65.6％、19.5％下降到12.6％、4.15％。 　　結(jié)論:①傳2代培養(yǎng)的AA大鼠滑膜細(xì)胞主要為FLS。②rh-Endost