基于L-賴氨酸骨架的APN抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、合成及活性研究.pdf

1、目的：氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)，也被稱為CD13，是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶，廣泛存在于小腸、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種細(xì)胞表面。與正常細(xì)胞相比，該酶在腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，APN在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。例如，APN可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)侵襲，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移；同時(shí)APN還可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，是腫瘤新生血管的調(diào)節(jié)器；另外該酶還能夠降解胸腺肽和白介素，從而降低

2、機(jī)體免疫機(jī)能。
　　 正因?yàn)锳PN與腫瘤的密切關(guān)系，APN抑制劑的研究已經(jīng)成為抗腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Bestatin作為第一個(gè)上市的APN抑制劑，臨床上主要用于治療急性成人非淋巴性白血病。近年又發(fā)現(xiàn)許多天然APN抑制劑，如Probestatin，Amastatin，Curcumin等；另外，人們還合成了許多小分子化合物APN抑制劑，如α-氨基磷酸抑制劑，β-氨基硫醇類抑制劑等。本課題組以APN為靶點(diǎn)，經(jīng)十幾年的研究亦報(bào)道了許

3、多小分子類肽化合物。
　　 本研究以APN為靶點(diǎn)，在充分調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，設(shè)計(jì)、合成一系列以L-賴氨酸為基本骨架的小分子化合物，并對(duì)它們進(jìn)行初步的活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有較好的APN抑制活性的先導(dǎo)化合物。
　　 方法：由APN的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式可以看出與APN活性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，對(duì)應(yīng)的APN抑制劑應(yīng)由三個(gè)部分組成：A疏水性芳環(huán)側(cè)鏈；B鋅離子螯合基團(tuán)位于中間連接片段上；C疏水性芳環(huán)側(cè)鏈。

4、A和C兩個(gè)疏水側(cè)鏈經(jīng)B部分相連。
　　 本研究利用已知的APN抑制劑建立合理的APN受體評(píng)價(jià)模型，通過(guò)常見的鋅離子螯合基團(tuán)，采用SYBYL/Unity模塊從NCI2000化合物庫(kù)中挑選出具有鋅離子螯合基團(tuán)的化合物。而后將這些化合物與所建立的APN受體評(píng)價(jià)模型進(jìn)行對(duì)接，挑選出打分較高的化合物作為中靶化合物。在此過(guò)程中，庫(kù)中原有的APN抑制劑Bestatin(ID：265489)、Phebestin(ID：702307)、para-

5、hydroxybestatin(ID：327461)作為測(cè)試分子以驗(yàn)證方法的有效性。參考中靶化合物和一些已知的APN抑制劑，進(jìn)而設(shè)計(jì)了一系列結(jié)構(gòu)全新的以L-賴氨酸為骨架的目標(biāo)化合物。
　　 本研究將目標(biāo)化合物進(jìn)行了體外抑酶實(shí)驗(yàn)、體外腫瘤細(xì)胞(HL-60，ES-2，K562，A549，H7402，PLC)生長(zhǎng)抑制以及體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，從中篩選出具有APN抑制活性的抗癌先導(dǎo)化合物。
　　 結(jié)果：本文共設(shè)計(jì)并合成了44個(gè)目標(biāo)

6、化合物，并對(duì)所有化合物通過(guò)紅外光譜、核磁共振氫譜、電噴霧質(zhì)譜等方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物為新型化合物，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 在C系列化合物中，化合物C7的抑酶活性優(yōu)于兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥B6和Bestatin，化合物C20的抑酶活性與它們相近。在D系列化合物中，化合物D9、D15的抑酶活性優(yōu)于兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥B6和Bestatin，化合物D24的抑酶活性與二者相近。
　　 MTT法體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定了目

7、標(biāo)化合物對(duì)HL-60人白血病細(xì)胞株、ES-2卵巢透明癌細(xì)胞株、K562人白血病細(xì)胞株、A549人肺腺癌細(xì)胞株、H7402人肝癌細(xì)胞株及PLC人肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示對(duì)APN酶抑制作用較強(qiáng)的化合物C7、D9、D14、D15、D23同樣有很強(qiáng)的HL-60細(xì)胞抑制活性，超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin；化合物D14、D21的ES-2細(xì)胞抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照，D23與之相當(dāng)；化合物D21的H7402細(xì)胞抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照，C7、D

8、24與之相當(dāng)；化合物C7、C20、D9、D14、D15、D19、D21、D23、D24的PLC細(xì)胞抑制活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照。
　　 本文在虛擬篩選的基礎(chǔ)上，以所設(shè)計(jì)、合成的化合物為對(duì)象，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行了初步的定量構(gòu)效關(guān)系總結(jié)。采用比較分子場(chǎng)分析方法(CoMFA)建立了L-賴氨酸類APN抑制劑的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型。通過(guò)對(duì)CoMFA模型立體場(chǎng)等勢(shì)線圖和靜電場(chǎng)等勢(shì)線圖的分析，建立的COMFA模型具有較高的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2和

9、一定的預(yù)測(cè)能力。
　　 最后，我們還得到一個(gè)化合物D24與突變嗜酸熱源菌三角交互作用因子F3的共結(jié)晶復(fù)合物。
　　 結(jié)論：本研究基于APN的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成的L-賴氨酸類化合物具有很好的APN抑制活性。所設(shè)計(jì)的合成路線科學(xué)合理，原料經(jīng)濟(jì)易得。通過(guò)初步的活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)了具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值的抗癌先導(dǎo)化合物。其中，化合物C7、D9、D15的抑酶活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin，可作為