強直性脊柱炎關(guān)節(jié)滑膜高表達碳酸酐酶1.pdf

1、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)發(fā)病機理目前尚未明確，眾多學(xué)者認為其是慢性炎癥性疾病，為自身免疫系統(tǒng)發(fā)生不當(dāng)應(yīng)當(dāng)誘發(fā)自身組織損害，該病的發(fā)病目前可以明確與遺傳、環(huán)境等多因素有關(guān)聯(lián)。人類白細胞抗原B27目前被認為可能在強直性脊柱炎的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用；隨著研究的深入而廣泛開展，近幾年大量研究發(fā)現(xiàn)參與強直性脊柱炎發(fā)病的基因還包括：其他主要組織相容性復(fù)合體(MHC)類基因以及一些非MHC基因；從發(fā)病

2、的環(huán)境方便，學(xué)者們則主要是認為某些微生物感染可能參與了AS的發(fā)病，脊柱關(guān)節(jié)病等感染與免疫關(guān)聯(lián)的疾病之間存在關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)，感染在強直性脊柱炎發(fā)病機制中作為環(huán)境因素的地位也越來越受到學(xué)術(shù)界的重視；該病是以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的全身性自身免疫性疾病，可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，一般是髖關(guān)節(jié)最易受到侵犯，其他膝、踝關(guān)節(jié)侵犯臨床少見，肌腱、韌帶附著點炎性改變是強直性脊柱炎患者外周關(guān)節(jié)的特征性病理變化；嚴重者病情發(fā)展迅速嚴重者可導(dǎo)致脊柱及關(guān)節(jié)的強直，

3、從而導(dǎo)致患者脊柱及關(guān)節(jié)功能受到嚴重損害，影響正常生理活動。
　　 強直性脊柱炎(AS)是一種具高度遺傳性的疾病，這一點已經(jīng)為學(xué)術(shù)界所公認，從臨床發(fā)病看，遺傳特征亦是非常明顯；國內(nèi)外的學(xué)者多年來對強直性脊柱炎的家族發(fā)病的調(diào)查研究也充分證實了該病的遺傳特性，另外強直性脊柱炎孿生兄妹，特別是單卵雙胎或多胎者，發(fā)生強直性脊柱炎者明顯帶有基因遺傳特征；人類白細胞組織抗原HLAB-27抗原參與強直性脊柱炎的發(fā)病機制，而且在其整個病理生理機制

4、中可能起到核心的關(guān)鍵作用，諸多的研究結(jié)果佐證這一點，也為學(xué)界所不容置疑來；HLAB27轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，而且該動物模型有類似強直性脊柱炎的病變發(fā)生，更使學(xué)者們肯定了HLAB27與強直性脊柱炎發(fā)病息息相關(guān)；有研究表明與強直性脊柱炎發(fā)病機制強相關(guān)的是B-27各亞型共有序列特征(即B-27特異性抗原決定基)；人類白細胞抗原B-27亞型分布頻率在不同人種分布頻率有明顯差異，這一點也被世界各地學(xué)者在大量不同種族的患者中調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)而證實，但

5、無論哪種人群，一旦罹患強直性脊柱炎，其臨床表現(xiàn)卻無多大差異，所以學(xué)者們認為B-27的特異性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了強直性脊柱炎的發(fā)病，而并非人類白細胞抗原各亞型特異基團。目在強直性脊柱炎患者檢測到B-2701、B-2702、B-2703、B-2704、B-2705和B-2710亞型，其中自種人強直性脊柱炎患者與B-2705、B-2702有關(guān)。HLA B27亦可存在于正常人體內(nèi)，是人體內(nèi)額外的抗原遞呈分子，其主要作用是與β2微球蛋白形成復(fù)合物，選擇性結(jié)

6、合相應(yīng)的抗原肽，將其遞呈至細胞毒性淋巴細胞表面受體，進而引發(fā)機體免疫反應(yīng)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型HLA蛋白可被自然殺傷細胞上的殺傷免疫球蛋白受體識別，但是該機制是否參與AS的致病尚不清楚。近些年來除掉HLAB27，眾多學(xué)者將目光聚焦到許多非B27MHC基因；HLA B60首先被實驗證實在B27陽性的AS患者中出現(xiàn)率高于正常人群，另外在B27陰性的患者中陽性率也顯著要高的多；帶HLA60的人群中，臨床資料研究結(jié)果證實導(dǎo)致罹患強直性脊柱炎的

7、概率要較正常人高3～6倍；其他基因諸如許多HLA B等位基因也受到學(xué)界關(guān)注，有人提出HLA B與B27陰性的AS發(fā)病相關(guān)，明確的如B7與B27陰性的美國非裔AS患病相關(guān)，B16、B35以及B62與B27陰性的高加索AS患病相關(guān)，B38、B39與日本B27陰性的AS患者發(fā)病相關(guān)，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70與墨西哥AS發(fā)病相關(guān)。這些基因的提出雖然尚未得到確認，但也為AS的致病機制的探索提供了更為廣闊的探索

8、空間。還有很多學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)向免疫學(xué)異常方面，提出錯誤折疊學(xué)說、表面同型二聚體學(xué)說等假說，認為細胞表面表達自由重鏈，形成重鏈二聚體，增加了重鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊，導(dǎo)致了應(yīng)激反應(yīng)，錯誤折疊產(chǎn)生的HLA B27分子在細胞表面的肽被自身免疫細胞識別，CD4+T細胞反應(yīng)則相應(yīng)地受到激活；這些CD4+T細胞可以與HLA B27的異常形式反應(yīng)，尤其是B27重鏈二聚體可以模擬MHCⅡ類分子而被CD4+T細胞識別引發(fā)自身免疫反應(yīng).此外，自由的重鏈二聚

9、體還能被Ig樣受體結(jié)合，暴露于天然免疫細胞表面，干擾正常的HLAⅠ型介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。但是歐洲學(xué)者Tran等對HLA B27轉(zhuǎn)基因大鼠的研究結(jié)果卻步支持這個理論，目前大多數(shù)學(xué)者比較支持分子模擬學(xué)說，該學(xué)說認為外源肽如某些微生物與HLAB27的致病亞型的某些成分相似，外源肽進入機體后，通過分子模擬引發(fā)機體對自身抗原成分(即HLA B27)發(fā)生異常免疫反應(yīng)，即自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。耶爾森菌、沙門菌、志賀菌、克雷伯菌均有成分與HLA

10、 B27分子α1螺旋可變區(qū)的第70～78氨基酸序列相同，提示腸道桿菌可能通過分子模擬機制參與AS的致病，符合衣原體與人類HSP約有75％的氨基酸序列相似，自身的HSP60與機體對衣原體HSP60產(chǎn)生的抗體IgA有交叉反應(yīng)；此外，對衣原體基因組的篩查發(fā)現(xiàn)衣原體DNA引物酶(211～222)與HLA B27配體(309～320)存在相似片段，該片段在體外與B27分子結(jié)合的能力與B2702、B2704、B2705相類同。故推測，持續(xù)存在于機體

11、內(nèi)的衣原體的某些片段作為內(nèi)源性肽可模擬機體自身的HLA B27配體，被HLA B27分子遞呈，從而引發(fā)機體的自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致了AS的發(fā)生。已證實衣原體產(chǎn)生的內(nèi)源性片段在活體內(nèi)也可被人細胞上的HLA B27遞呈。此外，沙眼衣原體610編碼的基因產(chǎn)物也可被B2705細胞遞呈，且沙眼衣原體某些基因序列與人體內(nèi)的某些蛋白所含的序列相似，這些序列還包括了HLA B27結(jié)合基序。這些研究結(jié)果均支持衣原體可能通過分子模擬的機制參與HLA B27相關(guān)

12、疾病的發(fā)生，但是其與AS的關(guān)聯(lián)尚需要進一步研究確認。
　　 反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(reactivearthritis，ReA)與強直性脊柱炎同屬于血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，臨床跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎最終發(fā)展為強直性脊柱炎；細菌感染誘發(fā)ReA已經(jīng)得到大量研究的證實，然而微生物感染在AS中的地位仍在探索中。Mart姬nez等對墨西哥AS患者研究發(fā)現(xiàn)，AS患者臨床感染率達50％，其中腸道和上呼吸道感染率占82％，表明感染在強直性脊柱炎發(fā)病中起著非

13、常重要的作用；前被提出的與AS發(fā)病可能相關(guān)的主要有肺炎克雷伯菌、沙門菌等腸道G-菌和衣原體等。早期對于肺炎克雷伯菌與AS的研究很多，學(xué)者們對AS患者糞便、血清等進行了多種檢測，由于檢測方法、研究對象等不同，得出的結(jié)論存在爭議；斯通等對強直性脊柱炎家族成員的研究后結(jié)果顯示：用Kp感染AS患者與正常人外周血淋巴細胞，家族中發(fā)病成員與未發(fā)病成員均可出現(xiàn)免疫反應(yīng)。無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，在AS家族中患病成員與未發(fā)病者、以及正常對照者外周血Kp抗體陽

14、性率均無明顯差別；故Kp在AS發(fā)病中的作用有待于進一步研究確認，腸道寄生G-菌(如沙門菌、耶爾森菌、變形桿菌等)也被提出可能參與了AS的發(fā)病。至今為止，對患者外周血、關(guān)節(jié)滑膜、滑液以及糞便培養(yǎng)均未發(fā)現(xiàn)某一特定的細菌與AS存在確實的關(guān)聯(lián)；衣原體導(dǎo)致ReA的發(fā)病已得到臨床資料及基礎(chǔ)實驗的證實，Carter等運用聚合酶鏈反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)未分化脊柱關(guān)節(jié)病(undifferentiatedspondyloarthropathy，uSpA)患者滑膜組織

15、中衣原體DNA陽性率高達62％，也為衣原體參與了uSpA的發(fā)病提供了直接有力的證據(jù)。uSpA與AS同屬于血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，且此次實驗研究的uSpA患者中，88％存在單側(cè)影像學(xué)表現(xiàn)為2～3級的骶髂關(guān)節(jié)炎，有炎性背痛，而單側(cè)3級以上的骶髂關(guān)節(jié)炎加上背痛強直性脊柱炎的診斷就可成立。故此次研究結(jié)果間接提示衣原體感染與AS發(fā)病之間可能也存在關(guān)聯(lián)。關(guān)于衣原體與AS的研究較少，早期主要定位于沙眼衣原體，但未能明確其關(guān)聯(lián)，尚待于進一步研究。強直性脊柱

16、炎的發(fā)病機理目前學(xué)術(shù)界尚未明晰，但普片認為其在遺傳、炎癥或感染等多種因素共同作用，從而誘發(fā)自身免疫，導(dǎo)致組織損害的疾??；目前的研究顯示HLA B27與AS發(fā)病存在著密切的聯(lián)系，眾多非B27MHC基因及非MHC基因的提出為AS致病機制的探索提供了廣泛的思路。環(huán)境因素方面，衣原體以及其他微生物與脊柱關(guān)節(jié)病的關(guān)系的提出也為AS的發(fā)病研究提供了新的線索。然而，明確參與AS發(fā)病的微生物，進而研究其參與致病的機制有待于更多更深入的研究。相信通過綜合

17、分析遺傳、環(huán)境等多因素的相互作用AS發(fā)病機制在不久的將來將被揭開，病因?qū)W研究的突破為AS的診斷、治療以及預(yù)防會帶來全面的革新。
　　 本課題研究框架如下：新骨形的過度生成以及骨吸收能力的增強是強直性脊柱炎(AS)的重要病理特征。諸多證據(jù)表明AS病人滑膜的病理變化與該病的病變嚴重程度密切相關(guān)，本研究用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較AS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，骨關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜組織的蛋白表達譜，篩選AS疾病相關(guān)的特異性表達蛋白。方法AS滑膜

18、取自髖關(guān)節(jié)，RA和OA滑膜取自膝關(guān)節(jié)。提取每個滑膜(每種疾病n=10)的總蛋白，然后按等比例濃度混合分別制備每種疾病的樣本池。用雙向凝膠電泳分析AS、RA、OA滑膜的蛋白表達譜，用質(zhì)譜分析方法鑒定AS中特異高表達的蛋白。用免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法逐一分析靶蛋白在每個滑膜中的表。結(jié)果與RA和OA相比，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶1(carbonic anhydraso I，CA1)在AS滑膜中特異性高表達。免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡均證

19、實CA1在AS滑膜中明顯表達(p=0.01)。結(jié)論本研究結(jié)果表明，CA1在強直性脊柱炎的滑膜組織表達量明顯高于在RA、OA中的表達量，Westernblotting和免疫組織化學(xué)實驗均已證實；通過ELISA實驗也證實了，強直性脊柱炎滑膜液中的CA1的表達水平明顯高于在RA、OA滑膜液中表達量的70％以上；推測AS滑膜液中的CA1有可能是AS滑膜分泌而來，以上結(jié)果充分表明CA1在AS中具有特異性高表達。CA1能促進二氧化碳與水結(jié)合成碳酸氫

20、鹽。Parissa等實驗CA1參與二氧化碳的水化作用的效果和碳酸鈣形成過程。他們在Tris緩沖液中加入氯化鈣和CA1進行混勻，然后加入二氧化碳，隨著CA1濃度和溫度的升高，發(fā)現(xiàn)CA1促進碳酸鈣沉淀的形成。Samana等，實驗發(fā)現(xiàn)從費氏檸檬酸中純化出的碳酸酐酶能促進二氧化碳和氯化鈣的反應(yīng)生成碳酸鈣沉淀。然后加入EDTA和碳酸酐酶阻斷劑乙酰唑胺后發(fā)現(xiàn)碳酸鈣急劇下降。這個結(jié)果說明CA1不但可以促進二氧化碳的水化反應(yīng)，而且還促進碳酸鈣沉淀形成。

21、因此，CA1在AS滑膜中過度表達可能會導(dǎo)致病變組織的鈣化。AS的病理表現(xiàn)之一是在慢性炎癥部位有病理性新骨形成，骨的主要組成部分是磷酸鈣和碳酸鈣；在骨的形成過程中，成骨細胞分泌一種基質(zhì)叫骨樣，它是由膠原蛋白和粘多糖構(gòu)成的一種膠狀物，骨樣會使無機鹽形成一種堅硬結(jié)晶叫礦化骨。在生理環(huán)境下，一般會抑制鈣鹽晶體的形成以保持平衡。因此，CA1在AS滑膜的過度表達可能會加速鈣鹽的沉淀而產(chǎn)生病變的礦化。乙酰唑胺是碳酸酐酶1阻斷劑，該藥物用于眼炎的治療效

22、果顯著；諸多研究可以發(fā)現(xiàn)患眼炎的病人常常會伴有強直性脊柱炎的發(fā)病，大約一半的此類患者HLA-B27檢測為陽性，所以可以大膽推測AS患者滑膜組織中CA1的高表達可能解釋了這兩種疾病發(fā)病的關(guān)聯(lián)特性，另一個證據(jù)是碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺和甲醋唑胺都可以用于治療強直性脊柱炎，而且效果良好。CA參與鈣化和礦化的生理和病理活動。二維電泳分析CA在大鼠牙釉質(zhì)的發(fā)育過程中，可以引起礦化而形成晶體核。禽類的蛋殼是由有機基質(zhì)和碳酸鈣結(jié)晶構(gòu)成，CA可以刺激蛋殼

23、的結(jié)晶生長，從而導(dǎo)致融合的結(jié)晶聚集。在蛋殼形成的過程中，我們可以利用乙酰唑胺來抑制鈣離子的沉積；研究發(fā)現(xiàn)CA也參與到無脊柱動物的內(nèi)骨骼的形成。在生物礦化作用中，從軟體動物分離出來的α-CA起著很重要的作用。α-CA的分泌物具有催化功能，它可以促進珊瑚礁鈣化。珊瑚蟲體內(nèi)的碳酸酐酶可以使海水鈣與碳酸鹽反應(yīng)生成碳酸鈣。實驗證明，珍珠貝殼純化可以得到新的碳酸酐酶，在生物礦化作用下，珍珠的形成呈上調(diào)。這些研究也同時說明了CA1在AS患者滑膜骨化過

24、程中的高表達會促使鈣化。
　　 本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)的辦法發(fā)現(xiàn)在AS的滑膜中，α-1-抗胰蛋白酶也是高表達，α-1-抗胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶的抑制劑；有報道也證明α-1-抗胰蛋白酶參與AS的病理途徑，在AS的免疫血清中發(fā)現(xiàn)α-1-抗胰蛋白酶的免疫球蛋白高表達，與AS的臨床指標及其相關(guān)。α-1-抗胰蛋白酶在AS滑膜中表達同時驗證了我們實驗方案的可行性和真實性?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)CA1在AS滑膜組織和滑膜液中的高表達，另外也證明了CA