乙狀結腸陰道黏膜神經分布與性生活關系及組織工程陰道動物模型構建的初步研究.pdf

1、陰道成形術是解決先天性無子宮無陰道( Mayer-Rokitansky-KusterHauser syndrome，MRKHS)患者性生活和性角色的主要方法。手術方式較多，臨床上常采用自體或異體組織移植以及應用人工代用品植入尿道和直腸之間的人工腔穴做襯里進行陰道重建。乙狀結腸代陰道成形術是較常用的一種術式，該術式成功率高，構建的陰道具有足夠的長度、寬度和潤滑，不易攣縮，多數(shù)文獻報道患者有滿意的性生活。我們前期研究已經觀察到帶蒂腸段形成新

2、陰道后其組織形態(tài)、分泌功能和防御功能都發(fā)生了一系列的適應性改變，但與性活動關系密切的神經纖維在移位后的乙狀結腸黏膜的分布和數(shù)量是否會發(fā)生變化?這種變化與患者的性生活質量有何關系?目前尚無相關研究，本研究第一部分以此為切入點，探討乙狀結腸陰道神經分布和功能之間的關系。
　　 結合國內外對不同陰道成形術的臨床效果以及手術近期和遠期并發(fā)癥的觀察研究，發(fā)現(xiàn)盡管傳統(tǒng)的陰道成形術解決了患者的痛苦，但同時也存在不同程度的缺陷。自體組織可造成機

3、體的額外損傷，來源有限，異體組織存在免疫排斥和傳播疾病的風險，而且利用這些非陰道組織再造的陰道在形態(tài)學和組織學方面與自然陰道組織差別較大，在功能上存在一定的局限性。因此，探索和改進陰道成形方法是必要而迫切的，組織工程學(tissue engineering)的興起為其提供了空間和可能。本研究嘗試構建組織工程陰道動物模型，期望建立形態(tài)和功能均接近正常的人工陰道，從而為在人體實現(xiàn)永久性替代、完美的形態(tài)修復和真正意義上的功能重建提供實驗依據(jù)。

4、
　　 第一部分：乙狀結腸代陰道成形術后陰道黏膜神經分布、雌激素受體表達及與性生活質量的關系
　　 目的：檢測乙狀結腸代陰道成形術后陰道黏膜神經分布和雌激素受體(ER)表達的變化，探討局部黏膜神經纖維密度和ER表達與患者性生活質量的關系，為乙狀結腸陰道功能的評估和合理術式的選擇提供依據(jù)。
　　 方法：2006年1月～2010年12月，選擇在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦產科接受乙狀結腸代陰道成形術的MRKHS患者為研究對

5、象。觀察人工陰道解剖結構，對有性生活者，采用女性性功能量表(FSFI)中調查手術后患者近期的性生活質量。留取手術時患者乙狀結腸斷端黏膜(乙狀結腸組，n=24)，隨訪時取該患者的人工陰道黏膜組織（人工陰道組，n=24），取同期因非陰道疾患住院治療患者的陰道黏膜（自然陰道組，n=10）。采用免疫組化法檢測局部組織中的蛋白基因產物9.5(PGP9.5)的表達、血管活性腸肽(VIP)能神經和神經肽Y(NPY)能神經的分布和密度，以及ER的表達；

6、實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測上述指標的mRNA表達；進一步分析人工陰道神經密度和ER表達與隨訪時限有無相關性；分析人工陰道神經分布和密度改變、ER表達和患者性功能指數(shù)評分之間的相關性。
　　 結果：
　　 1患者一般情況和FSFI評分
　　 隨訪時限3個月～39個月。術后人工陰道外觀與自然陰道相似，平均長度10.6±2.4cm，平均寬度2.9士0.6cm。隨訪時有性生活者17例(70.8％)，性生活史從

7、2個月～30個月不等?；颊逨SFI平均得分為24.11士1.33，23～29分之間有15例(88.2％)，低于23分2例(11.8％)。其中性欲望評分為4.18士0.51，性興奮4.04士0.55，陰道潤滑3.57士0.49，性高潮4.00±0.48，性滿意度5.06士0.65，疼痛3.25±0.90。
　　 2神經分布特征
　　 人工陰道黏膜組織的固有層、黏膜肌層、黏膜下層和肌層可見豐富的PGP9.5陽性表達的神經纖維

8、，VIP和NPY表達陽性的神經纖維主要分布在血管周圍和肌層；人工陰道黏膜組織中PGP9.5陽性表達的神經纖維密度分別高于VIP和NPY陽性表達的神經密度（38.22士8.93vs7.45±2.01，6.13士2.38，P＜0.05）。人工陰道的神經分布特征與乙狀結腸相似。陽性神經纖維主要分布在自然陰道的固有層和肌層。
　　 3人工陰道PGP9.5、VIP和NPY蛋白和mRNA的表達
　　 本研究隨訪期限內，人工陰道黏膜P

9、GP9.5、VIP、NPY陽性神經纖維的IOD均低于原位乙狀結腸黏膜（38.22士8.93vs46.12士6.63，P1＜0.05；7.45士2.01vs9.74±2.19,P2＜0.05;6.13士2.38vs8.38±2.51，P3＜0.05），但高于自然陰道黏膜（38.22士8.93vs22.76±6.61，P1＜0.05;7.45士2.01vs4.59士1.76,P2＜0.05;6.13士2.38vs3.58士1.23,P3＜0

10、.05）。
　　 人工陰道PGP9.5、VIP和NPYmRNA表達均較原位乙狀結腸降低(7.94±1.92vs10.17±2.24,P1＜0.05；2.37±0.87vs4.14±1.32，P2＜0.05；2.68±0.75vs3.79士0.98，P3＜0.05)，較自然陰道黏膜高（7.94±1.92vs5.68士0.47，P1＜0.05;2.37±0.87vs1.04士0.36，P2＜0.05;2.68士0.75vs1.15士

11、0.33，P3＜0.05)。
　　 4人工陰道PGP9.5、VIP和NPY的表達與隨訪時限的相關性
　　 人工陰道黏膜PGP9.5、VIP能陽性神經纖維表達與隨訪時限均呈正相關(r1=0.73，P1=0.01;r2=0.16，P2=0.04)，即隨時間推移，移位的乙狀結腸總的神經纖維密度和VIP能神經纖維密度降低后又有逐步回升趨勢。人工陰道黏膜NPY能陽性神經纖維表達與隨訪時限無相關性(r=0.30，P=0.38)。

12、r>　　 5人工陰道ER蛋白和mRNA表達及與隨訪時限的相關性
　　 與原位乙狀結腸比，人工陰道黏膜ER蛋白和mRNA表達明顯升高（19.56士5.29vs10.49±2.84，P1＜0.05;4.36士1.41vs2.31士0.75，P2＜0.05），但仍低于自然陰道黏膜的表達水平（19.56士5.29vs27.83±6.78，P1＜0.05；4.36士1.41vs9.59±2.64，P2＜0.05）。ER在人工陰道黏膜的表

13、達與隨訪時限呈正相關(r=0.92，P=0.00)，即隨時間推移，ER表達逐步升高，但在本研究隨訪期限內，仍低于自然陰道。
　　 6人工陰道神經分布、雌激素受體表達與患者性生活質量的相關性
　　 PGP9.5和VIPmRNA表達與ERmRNA表達呈正相關(r1=0.66，P1=0.03;r2=0.65，P2=0.03)；NPYmRNA表達與ERmRNA表達無相關性（r=0.46，P=0.15）。FSFI與PGP9.5、V

14、IPmRNA及NPYmRNA表達均無相關性（r1=0.12,P1=0.72;r2=0.25，P2=0.43;r3=-0.47，P3=0.13）；FSFI與ER表達無相關性(r=0.50，P=0.12)。
　　 結論：
　　 1通過對乙狀結腸代陰道成形術后患者的性功能指數(shù)調查，發(fā)現(xiàn)該術式可使患者獲得較理想的性生活質量。
　　 2人工陰道黏膜的神經分布特征與原位乙狀結腸相似，其神經纖維密度介于乙狀結腸和自然陰道之間，

15、且隨時間推移逐步回升，這種適應性改變可能是改善患者遠期性生活質量的基礎。
　　 3人工陰道黏膜ER表達隨時間的推移逐漸升高，提示移位后的乙狀結腸黏膜對雌激素的敏感性增高，可能是移位后乙狀結腸發(fā)生適應性改變及人工陰道pH值降低的基礎。
　　 4人工陰道黏膜PGP9.5和VIPmRNA表達與ER表達存在正相關，提示雌激素可能對局部神經有保護和促進再生作用。
　　 5在對患者術后3年隨訪的研究期間，問卷調查顯示患者FS

16、FI評分與人工陰道的神經纖維密度和ER表達無明顯相關性，提示影響性功能的因素復雜，需進一步深入廣泛的研究。
　　 第二部分：原代培養(yǎng)大鼠陰道黏膜上皮細胞的研究
　　 目的：探討大鼠陰道黏膜上皮細胞的體外培養(yǎng)和擴增技術，為構建組織工程化陰道動物模型提供種子細胞。
　　 方法：(1)組織塊法：將SD大鼠陰道全層組織剪切成0.5～1mm2小塊，用解剖鑷均勻地接種于一次性塑料培養(yǎng)皿中，在37℃5％CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱

17、中靜置培養(yǎng)3.0h后，補加角化細胞無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。(2)酶消化法：取大鼠陰道全層組織，Dispase酶消化后分離上皮層，0.25％胰酶進一步消化成細胞懸液，接種于無血清角化細胞培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)。觀察兩種方法細胞生長所需時間、細胞形態(tài)和體外生長特性，繪制生長曲線，免疫組化鑒定。
　　 結果：
　　 1組織塊法于接種后3～5d有少量細胞自貼壁組織塊周圍爬出，3～4w后可傳代。酶消化法24～36h后細胞開始貼壁，至7-1

18、0d細胞生長至80％融合，傳代培養(yǎng)。
　　 2倒置顯微鏡下見上皮細胞呈不規(guī)則圓形或多邊形，連接成片后似鋪路石狀。掃描電鏡下細胞表面可見微絨毛嵴。兩種方法獲得的細胞形態(tài)一致，傳代后增殖特性和生長曲線基本一致。
　　 3組織塊法細胞培養(yǎng)成功率為37.5％，低于細胞法(50％)，差異有顯著性(P＜0.05)。組織塊法第一代細胞產量為2.67士0.23(x106/L)，酶消化法為2.89士0.94(x106/L)，差異無顯著性(

19、P＞0.05)。
　　 4角蛋白染色陽性，組織塊法細胞純度為92％，酶消化法為98％。第四代細胞為正常二倍體核型。
　　 結論：兩種細胞培養(yǎng)方法均能獲得不規(guī)則圓形或多邊形的陰道上皮細胞，但酶消化法較組織塊法細胞貼壁快，生長時間短，細胞增殖良好，成功率高，能較迅速獲得較多細胞用于組織工程陰道的構建。第三部分：聚乳酸-羥基乙酸/Ⅰ型膠原復合支架與陰道上皮細胞的相容性研究
　　 目的：利用組織工程學原理，探討聚乳酸-羥

20、基乙酸(PLGA)/Ⅰ型膠原復合支架材料與陰道上皮細胞的生物相容性，驗證該材料作為組織工程陰道支架的可行性。
　　 方法：酶消化法培養(yǎng)SD大鼠陰道上皮細胞，制備PLGA/Ⅰ型膠原支架材料。四甲基偶氮唑鹽法測定支架材料浸提液對上皮細胞的毒性。上皮細胞接種于PLGA/Ⅰ型膠原支架材料上體外培養(yǎng)，檢測細胞與支架材料的黏附率，掃描電鏡觀察細胞在支架材料上的生長情況。將培養(yǎng)的細胞-支架材料移植到大鼠背部皮下，分別于2、4、8周取材，HE染

21、色、免疫組化觀察細胞在支架材料上的生長增殖。
　　 結果：大鼠陰道上皮細胞在PLGA/Ⅰ型膠原支架材料的浸提液中生長及增殖良好。PLGA/Ⅰ型膠原支架的細胞黏附率為71.8％士9.2％，明顯高于PLGA支架材料（63.4％士5.7％）。掃描電鏡觀察上皮細胞在復合支架材料上黏附、生長良好。皮下埋植2周，細胞在支架孔隙內生長增殖，成纖維細胞生長；4周材料表面形成1～3層上皮；8周后，支架材料部分降解，上皮層次增加，呈極性排列，廣譜角

22、蛋白免疫組化染色陽性。
　　 結論：PLGA/Ⅰ型膠原復合材料適合陰道上皮細胞的黏附生長，具有良好的相容性，可作為支架材料用于構建組織工程陰道。第四部分：組織工程陰道動物模型的構建
　　 目的：利用組織工程學原理，體外分離培養(yǎng)SD大鼠陰道上皮細胞，以PLGA/Ⅰ型膠原為支架材料，構建人工陰道動物模型，以探討更理想的陰道成形新術式的可行性，為進一步臨床應用奠定實驗基礎。
　　 方法：取10只SD大鼠陰道黏膜體外分離

23、培養(yǎng)上皮細胞，接種于管狀PLGA/Ⅰ型膠原支架材料的內側面，體外培養(yǎng)后原位移植到去除陰道的大鼠體內，分別于術后1、3、6個月處死動物，HE染色、Masson's染色和免疫組化動態(tài)觀察組織學變化。
　　 結果：
　　 1大鼠的組織工程陰道重建手術成功完成。1只死于麻醉過量，觀察過程中3只大鼠發(fā)生腹腔感染，其中2只死亡，1只陰道閉鎖，其余6只大鼠陰道切口愈合良好，無陰道狹窄和塌陷。
　　 2大體觀察：1個月，陰道腔內

24、可見島狀分布的黏膜，極薄，色紅，支架材料少部分降解，陰道深度約1.4cm;3個月，陰道黏膜漸增厚，粉紅色，有光澤，支架材料大部分降解，陰道深度約1.2cm.;術后6個月，組織工程陰道黏膜類似正常陰道黏膜，陰道深度約1.2cm.，無明顯狹窄。
　　 3組織學觀察：術后1個月，僅有1～3層上皮細胞，未見平滑肌層，血管稀疏，膠原纖維較少，不均勻分布；術后3個月，上皮層增多，極性排列，可見少許平滑肌，間斷存在，膠原纖維增多，欠整齊；術后