乙狀結(jié)腸陰道黏膜神經(jīng)分布與性生活關(guān)系及組織工程陰道動(dòng)物模型構(gòu)建的初步研究.pdf

1、陰道成形術(shù)是解決先天性無(wú)子宮無(wú)陰道( Mayer-Rokitansky-KusterHauser syndrome，MRKHS)患者性生活和性角色的主要方法。手術(shù)方式較多，臨床上常采用自體或異體組織移植以及應(yīng)用人工代用品植入尿道和直腸之間的人工腔穴做襯里進(jìn)行陰道重建。乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)是較常用的一種術(shù)式，該術(shù)式成功率高，構(gòu)建的陰道具有足夠的長(zhǎng)度、寬度和潤(rùn)滑，不易攣縮，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道患者有滿(mǎn)意的性生活。我們前期研究已經(jīng)觀(guān)察到帶蒂腸段形成新

2、陰道后其組織形態(tài)、分泌功能和防御功能都發(fā)生了一系列的適應(yīng)性改變，但與性活動(dòng)關(guān)系密切的神經(jīng)纖維在移位后的乙狀結(jié)腸黏膜的分布和數(shù)量是否會(huì)發(fā)生變化?這種變化與患者的性生活質(zhì)量有何關(guān)系?目前尚無(wú)相關(guān)研究，本研究第一部分以此為切入點(diǎn)，探討乙狀結(jié)腸陰道神經(jīng)分布和功能之間的關(guān)系。
　　 結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)不同陰道成形術(shù)的臨床效果以及手術(shù)近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥的觀(guān)察研究，發(fā)現(xiàn)盡管傳統(tǒng)的陰道成形術(shù)解決了患者的痛苦，但同時(shí)也存在不同程度的缺陷。自體組織可造成機(jī)

3、體的額外損傷，來(lái)源有限，異體組織存在免疫排斥和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，而且利用這些非陰道組織再造的陰道在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方面與自然陰道組織差別較大，在功能上存在一定的局限性。因此，探索和改進(jìn)陰道成形方法是必要而迫切的，組織工程學(xué)(tissue engineering)的興起為其提供了空間和可能。本研究嘗試構(gòu)建組織工程陰道動(dòng)物模型，期望建立形態(tài)和功能均接近正常的人工陰道，從而為在人體實(shí)現(xiàn)永久性替代、完美的形態(tài)修復(fù)和真正意義上的功能重建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、
　　 第一部分：乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)后陰道黏膜神經(jīng)分布、雌激素受體表達(dá)及與性生活質(zhì)量的關(guān)系
　　 目的：檢測(cè)乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)后陰道黏膜神經(jīng)分布和雌激素受體(ER)表達(dá)的變化，探討局部黏膜神經(jīng)纖維密度和ER表達(dá)與患者性生活質(zhì)量的關(guān)系，為乙狀結(jié)腸陰道功能的評(píng)估和合理術(shù)式的選擇提供依據(jù)。
　　 方法：2006年1月～2010年12月，選擇在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科接受乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)的MRKHS患者為研究對(duì)

5、象。觀(guān)察人工陰道解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)有性生活者，采用女性性功能量表(FSFI)中調(diào)查手術(shù)后患者近期的性生活質(zhì)量。留取手術(shù)時(shí)患者乙狀結(jié)腸斷端黏膜(乙狀結(jié)腸組，n=24)，隨訪(fǎng)時(shí)取該患者的人工陰道黏膜組織（人工陰道組，n=24），取同期因非陰道疾患住院治療患者的陰道黏膜（自然陰道組，n=10）。采用免疫組化法檢測(cè)局部組織中的蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)的表達(dá)、血管活性腸肽(VIP)能神經(jīng)和神經(jīng)肽Y(NPY)能神經(jīng)的分布和密度，以及ER的表達(dá)；

6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)上述指標(biāo)的mRNA表達(dá)；進(jìn)一步分析人工陰道神經(jīng)密度和ER表達(dá)與隨訪(fǎng)時(shí)限有無(wú)相關(guān)性；分析人工陰道神經(jīng)分布和密度改變、ER表達(dá)和患者性功能指數(shù)評(píng)分之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1患者一般情況和FSFI評(píng)分
　　 隨訪(fǎng)時(shí)限3個(gè)月～39個(gè)月。術(shù)后人工陰道外觀(guān)與自然陰道相似，平均長(zhǎng)度10.6±2.4cm，平均寬度2.9士0.6cm。隨訪(fǎng)時(shí)有性生活者17例(70.8％)，性生活史從

7、2個(gè)月～30個(gè)月不等?；颊逨SFI平均得分為24.11士1.33，23～29分之間有15例(88.2％)，低于23分2例(11.8％)。其中性欲望評(píng)分為4.18士0.51，性興奮4.04士0.55，陰道潤(rùn)滑3.57士0.49，性高潮4.00±0.48，性滿(mǎn)意度5.06士0.65，疼痛3.25±0.90。
　　 2神經(jīng)分布特征
　　 人工陰道黏膜組織的固有層、黏膜肌層、黏膜下層和肌層可見(jiàn)豐富的PGP9.5陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)纖維

8、，VIP和NPY表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)纖維主要分布在血管周?chē)图樱蝗斯り幍鲤つそM織中PGP9.5陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)纖維密度分別高于VIP和NPY陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)密度（38.22士8.93vs7.45±2.01，6.13士2.38，P＜0.05）。人工陰道的神經(jīng)分布特征與乙狀結(jié)腸相似。陽(yáng)性神經(jīng)纖維主要分布在自然陰道的固有層和肌層。
　　 3人工陰道PGP9.5、VIP和NPY蛋白和mRNA的表達(dá)
　　 本研究隨訪(fǎng)期限內(nèi)，人工陰道黏膜P

9、GP9.5、VIP、NPY陽(yáng)性神經(jīng)纖維的IOD均低于原位乙狀結(jié)腸黏膜（38.22士8.93vs46.12士6.63，P1＜0.05；7.45士2.01vs9.74±2.19,P2＜0.05;6.13士2.38vs8.38±2.51，P3＜0.05），但高于自然陰道黏膜（38.22士8.93vs22.76±6.61，P1＜0.05;7.45士2.01vs4.59士1.76,P2＜0.05;6.13士2.38vs3.58士1.23,P3＜0

10、.05）。
　　 人工陰道PGP9.5、VIP和NPYmRNA表達(dá)均較原位乙狀結(jié)腸降低(7.94±1.92vs10.17±2.24,P1＜0.05；2.37±0.87vs4.14±1.32，P2＜0.05；2.68±0.75vs3.79士0.98，P3＜0.05)，較自然陰道黏膜高（7.94±1.92vs5.68士0.47，P1＜0.05;2.37±0.87vs1.04士0.36，P2＜0.05;2.68士0.75vs1.15士

11、0.33，P3＜0.05)。
　　 4人工陰道PGP9.5、VIP和NPY的表達(dá)與隨訪(fǎng)時(shí)限的相關(guān)性
　　 人工陰道黏膜PGP9.5、VIP能陽(yáng)性神經(jīng)纖維表達(dá)與隨訪(fǎng)時(shí)限均呈正相關(guān)(r1=0.73，P1=0.01;r2=0.16，P2=0.04)，即隨時(shí)間推移，移位的乙狀結(jié)腸總的神經(jīng)纖維密度和VIP能神經(jīng)纖維密度降低后又有逐步回升趨勢(shì)。人工陰道黏膜NPY能陽(yáng)性神經(jīng)纖維表達(dá)與隨訪(fǎng)時(shí)限無(wú)相關(guān)性(r=0.30，P=0.38)。

12、r>　　 5人工陰道ER蛋白和mRNA表達(dá)及與隨訪(fǎng)時(shí)限的相關(guān)性
　　 與原位乙狀結(jié)腸比，人工陰道黏膜ER蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高（19.56士5.29vs10.49±2.84，P1＜0.05;4.36士1.41vs2.31士0.75，P2＜0.05），但仍低于自然陰道黏膜的表達(dá)水平（19.56士5.29vs27.83±6.78，P1＜0.05；4.36士1.41vs9.59±2.64，P2＜0.05）。ER在人工陰道黏膜的表

13、達(dá)與隨訪(fǎng)時(shí)限呈正相關(guān)(r=0.92，P=0.00)，即隨時(shí)間推移，ER表達(dá)逐步升高，但在本研究隨訪(fǎng)期限內(nèi)，仍低于自然陰道。
　　 6人工陰道神經(jīng)分布、雌激素受體表達(dá)與患者性生活質(zhì)量的相關(guān)性
　　 PGP9.5和VIPmRNA表達(dá)與ERmRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r1=0.66，P1=0.03;r2=0.65，P2=0.03)；NPYmRNA表達(dá)與ERmRNA表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.46，P=0.15）。FSFI與PGP9.5、V

14、IPmRNA及NPYmRNA表達(dá)均無(wú)相關(guān)性（r1=0.12,P1=0.72;r2=0.25，P2=0.43;r3=-0.47，P3=0.13）；FSFI與ER表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.50，P=0.12)。
　　 結(jié)論：
　　 1通過(guò)對(duì)乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)后患者的性功能指數(shù)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該術(shù)式可使患者獲得較理想的性生活質(zhì)量。
　　 2人工陰道黏膜的神經(jīng)分布特征與原位乙狀結(jié)腸相似，其神經(jīng)纖維密度介于乙狀結(jié)腸和自然陰道之間，

15、且隨時(shí)間推移逐步回升，這種適應(yīng)性改變可能是改善患者遠(yuǎn)期性生活質(zhì)量的基礎(chǔ)。
　　 3人工陰道黏膜ER表達(dá)隨時(shí)間的推移逐漸升高，提示移位后的乙狀結(jié)腸黏膜對(duì)雌激素的敏感性增高，可能是移位后乙狀結(jié)腸發(fā)生適應(yīng)性改變及人工陰道pH值降低的基礎(chǔ)。
　　 4人工陰道黏膜PGP9.5和VIPmRNA表達(dá)與ER表達(dá)存在正相關(guān)，提示雌激素可能對(duì)局部神經(jīng)有保護(hù)和促進(jìn)再生作用。
　　 5在對(duì)患者術(shù)后3年隨訪(fǎng)的研究期間，問(wèn)卷調(diào)查顯示患者FS

16、FI評(píng)分與人工陰道的神經(jīng)纖維密度和ER表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，提示影響性功能的因素復(fù)雜，需進(jìn)一步深入廣泛的研究。
　　 第二部分：原代培養(yǎng)大鼠陰道黏膜上皮細(xì)胞的研究
　　 目的：探討大鼠陰道黏膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增技術(shù)，為構(gòu)建組織工程化陰道動(dòng)物模型提供種子細(xì)胞。
　　 方法：(1)組織塊法：將SD大鼠陰道全層組織剪切成0.5～1mm2小塊，用解剖鑷均勻地接種于一次性塑料培養(yǎng)皿中，在37℃5％CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱

17、中靜置培養(yǎng)3.0h后，補(bǔ)加角化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。(2)酶消化法：取大鼠陰道全層組織，Dispase酶消化后分離上皮層，0.25％胰酶進(jìn)一步消化成細(xì)胞懸液，接種于無(wú)血清角化細(xì)胞培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)。觀(guān)察兩種方法細(xì)胞生長(zhǎng)所需時(shí)間、細(xì)胞形態(tài)和體外生長(zhǎng)特性，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，免疫組化鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1組織塊法于接種后3～5d有少量細(xì)胞自貼壁組織塊周?chē)莱觯?～4w后可傳代。酶消化法24～36h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，至7-1

18、0d細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合，傳代培養(yǎng)。
　　 2倒置顯微鏡下見(jiàn)上皮細(xì)胞呈不規(guī)則圓形或多邊形，連接成片后似鋪路石狀。掃描電鏡下細(xì)胞表面可見(jiàn)微絨毛嵴。兩種方法獲得的細(xì)胞形態(tài)一致，傳代后增殖特性和生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本一致。
　　 3組織塊法細(xì)胞培養(yǎng)成功率為37.5％，低于細(xì)胞法(50％)，差異有顯著性(P＜0.05)。組織塊法第一代細(xì)胞產(chǎn)量為2.67士0.23(x106/L)，酶消化法為2.89士0.94(x106/L)，差異無(wú)顯著性(

19、P＞0.05)。
　　 4角蛋白染色陽(yáng)性，組織塊法細(xì)胞純度為92％，酶消化法為98％。第四代細(xì)胞為正常二倍體核型。
　　 結(jié)論：兩種細(xì)胞培養(yǎng)方法均能獲得不規(guī)則圓形或多邊形的陰道上皮細(xì)胞，但酶消化法較組織塊法細(xì)胞貼壁快，生長(zhǎng)時(shí)間短，細(xì)胞增殖良好，成功率高，能較迅速獲得較多細(xì)胞用于組織工程陰道的構(gòu)建。第三部分：聚乳酸-羥基乙酸/Ⅰ型膠原復(fù)合支架與陰道上皮細(xì)胞的相容性研究
　　 目的：利用組織工程學(xué)原理，探討聚乳酸-羥

20、基乙酸(PLGA)/Ⅰ型膠原復(fù)合支架材料與陰道上皮細(xì)胞的生物相容性，驗(yàn)證該材料作為組織工程陰道支架的可行性。
　　 方法：酶消化法培養(yǎng)SD大鼠陰道上皮細(xì)胞，制備PLGA/Ⅰ型膠原支架材料。四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定支架材料浸提液對(duì)上皮細(xì)胞的毒性。上皮細(xì)胞接種于PLGA/Ⅰ型膠原支架材料上體外培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞與支架材料的黏附率，掃描電鏡觀(guān)察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)情況。將培養(yǎng)的細(xì)胞-支架材料移植到大鼠背部皮下，分別于2、4、8周取材，HE染

21、色、免疫組化觀(guān)察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)增殖。
　　 結(jié)果：大鼠陰道上皮細(xì)胞在PLGA/Ⅰ型膠原支架材料的浸提液中生長(zhǎng)及增殖良好。PLGA/Ⅰ型膠原支架的細(xì)胞黏附率為71.8％士9.2％，明顯高于PLGA支架材料（63.4％士5.7％）。掃描電鏡觀(guān)察上皮細(xì)胞在復(fù)合支架材料上黏附、生長(zhǎng)良好。皮下埋植2周，細(xì)胞在支架孔隙內(nèi)生長(zhǎng)增殖，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；4周材料表面形成1～3層上皮；8周后，支架材料部分降解，上皮層次增加，呈極性排列，廣譜角

22、蛋白免疫組化染色陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：PLGA/Ⅰ型膠原復(fù)合材料適合陰道上皮細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)，具有良好的相容性，可作為支架材料用于構(gòu)建組織工程陰道。第四部分：組織工程陰道動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　 目的：利用組織工程學(xué)原理，體外分離培養(yǎng)SD大鼠陰道上皮細(xì)胞，以PLGA/Ⅰ型膠原為支架材料，構(gòu)建人工陰道動(dòng)物模型，以探討更理想的陰道成形新術(shù)式的可行性，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：取10只SD大鼠陰道黏膜體外分離

23、培養(yǎng)上皮細(xì)胞，接種于管狀PLGA/Ⅰ型膠原支架材料的內(nèi)側(cè)面，體外培養(yǎng)后原位移植到去除陰道的大鼠體內(nèi)，分別于術(shù)后1、3、6個(gè)月處死動(dòng)物，HE染色、Masson's染色和免疫組化動(dòng)態(tài)觀(guān)察組織學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1大鼠的組織工程陰道重建手術(shù)成功完成。1只死于麻醉過(guò)量，觀(guān)察過(guò)程中3只大鼠發(fā)生腹腔感染，其中2只死亡，1只陰道閉鎖，其余6只大鼠陰道切口愈合良好，無(wú)陰道狹窄和塌陷。
　　 2大體觀(guān)察：1個(gè)月，陰道腔內(nèi)

24、可見(jiàn)島狀分布的黏膜，極薄，色紅，支架材料少部分降解，陰道深度約1.4cm;3個(gè)月，陰道黏膜漸增厚，粉紅色，有光澤，支架材料大部分降解，陰道深度約1.2cm.;術(shù)后6個(gè)月，組織工程陰道黏膜類(lèi)似正常陰道黏膜，陰道深度約1.2cm.，無(wú)明顯狹窄。
　　 3組織學(xué)觀(guān)察：術(shù)后1個(gè)月，僅有1～3層上皮細(xì)胞，未見(jiàn)平滑肌層，血管稀疏，膠原纖維較少，不均勻分布；術(shù)后3個(gè)月，上皮層增多，極性排列，可見(jiàn)少許平滑肌，間斷存在，膠原纖維增多，欠整齊；術(shù)后