過(guò)表達(dá)癌基因Bmi-1促進(jìn)鼠源胚胎干細(xì)胞自我更新.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryoluc stem cells ESCs)是具有無(wú)限自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，其既可通過(guò)對(duì)稱(chēng)分裂保持不分化狀態(tài)，也可分化形成如淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。ES細(xì)胞自我更新必定要依賴(lài)于多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用來(lái)維持，對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究不僅對(duì)了解胚胎發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義，也能為胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。然而目前對(duì)于其相關(guān)信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，因此探索和研究新的信號(hào)分子對(duì)于進(jìn)一步

2、了解胚胎干細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制及分化機(jī)理非常必要。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells CSCs)是腫瘤細(xì)胞中存在的一群與胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性極為相似的細(xì)胞，近來(lái)研究結(jié)果顯示，胚胎干細(xì)胞中的自我更新標(biāo)志分子Nanog、Oct-4等在腫瘤干細(xì)胞中也異常表達(dá)，并參與其自我更新的調(diào)控，提示兩者可能存在相同的干性調(diào)控通路。癌基因Bmi-l在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并在維持CSCs及造血、神經(jīng)等成體干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮作用。胚胎干細(xì)胞中

3、也檢測(cè)到該基因的高表達(dá)，那么Bmi-1是否也同樣參與了胚胎干細(xì)胞中多能性的維持則是我們感興趣的問(wèn)題。 為了研究Bmi-1分子在胚胎干細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了Bmi-1鼠源真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞系CCE并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，最后通過(guò)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株與對(duì)照細(xì)胞在增殖、自我更新和分化等方面差異探討B(tài)mi-1分子對(duì)胚胎干細(xì)胞自我更新維持的作用。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.Bmi-1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建：Bmi-l

4、mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)mBmiCDSF/mBnuCDSR引物擴(kuò)增后，得到含有EcoRI和Sall酶切位點(diǎn)的Bmi-1全長(zhǎng)編碼序列，將該序列克隆至pCI-GFP載體中，得到N端融合表達(dá)EGFP熒光蛋白的pCI-GFP-bmil真核表達(dá)載體。 2.表達(dá)載體pCI-GFP-bmil在胚胎干細(xì)胞系CCE中的表達(dá)：將該表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CCE細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染pCI-GFP-bmil細(xì)胞中，熒光蛋白表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)；

5、而轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pCI-GFP的細(xì)胞中，熒光蛋白均勻分布。 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選和鑒定：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞于篩選培養(yǎng)液(含400μg/ml G418的ESC培養(yǎng)液)培養(yǎng)12天后，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，分別為過(guò)表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE和對(duì)照株pCG/CCE。DAPI染色后于共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)，pCGB/CCE細(xì)胞中EGFP-bmil融合蛋白特異性表達(dá)于細(xì)胞核中，與DAPI染色的細(xì)胞核重疊，并呈顆粒狀分布。半定量RT-PCR和免疫印

6、跡結(jié)果顯示EGFP-bmil融合蛋白正確表達(dá)。 4.Bmi-1對(duì)ES細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照株pCG/CCE相比，在同等培養(yǎng)條件下，pCGB/CCE細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。在LIF+培養(yǎng)條件下尤其顯著，在第5天可見(jiàn)細(xì)胞增殖數(shù)目的明顯差異。說(shuō)明過(guò)表達(dá)Bnu-1有助于促進(jìn)ES細(xì)胞增殖。 5.Bmi-1對(duì)ES細(xì)胞自我更新能力的影響：克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LIF+(10ng/ml)和LIF-1(1ng/ml)

7、培養(yǎng)條件下，pCG/CCE細(xì)胞形成的AP染色陽(yáng)性克隆率分別為45.7％和26.7％，與之相比，過(guò)表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE細(xì)胞AP染色陽(yáng)性克隆率則明顯增高，分別為71.4％和62％。對(duì)細(xì)胞中干性分子檢測(cè)的結(jié)果顯示：與對(duì)照株pCG/CCE相比，過(guò)表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE細(xì)胞中，干性分子nanog的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，oct-4和sox2分子的表達(dá)也略有上調(diào)。而c-myc的mRNA表達(dá)水平則顯著降低。隨后對(duì)Nanog和c

8、-Myc行蛋白印跡結(jié)果顯示與分子水平表達(dá)一致。說(shuō)明Bmi-1可促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新。 6.Bmi-1對(duì)ES細(xì)胞分化的影響：無(wú)LIF篩選培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)及誘導(dǎo)形成EB分化后，對(duì)細(xì)胞中的干性分子和分化標(biāo)志分子進(jìn)行檢測(cè)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞中，干性分子如Nanog等表達(dá)較高而分化標(biāo)志分子如GATA6、GATA4表達(dá)則較低。說(shuō)明Bmi-1分子的過(guò)表達(dá)會(huì)阻礙ES細(xì)胞分化，特別是原始內(nèi)胚層方向。