Tfcp2l1促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的發(fā)育起始于精子(sperm)與卵子(oocyte)的結(jié)合，兩者形成受精卵(zygote)后啟動(dòng)發(fā)育程序，此后受精卵會(huì)經(jīng)歷一系列的卵裂(cleavage)，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，細(xì)胞功能形態(tài)差異化。1981年由Evans和Kaufman從小鼠著床前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中成功分離了小鼠的胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)，由此建立了最早的胚胎干細(xì)胞系。之后人們又陸續(xù)分離了人、大鼠等的胚胎干細(xì)胞。由于

2、胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特性，所以無論是在生物發(fā)育研究方面還是臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面都具有非常重要的研究價(jià)值。經(jīng)過前人的大量工作，現(xiàn)在人們已經(jīng)找到能夠在體外長期維持部分胚胎干細(xì)胞自我更新狀態(tài)的方法。但是由于胚胎干細(xì)胞維持自我更新是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，因此全面深入的研究胚胎干細(xì)胞維持自我更新及分化的調(diào)控機(jī)制，有利于其廣泛而安全的應(yīng)用。
　　目前體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基主要有兩種:一種是LIF/serum培養(yǎng)基;一種

3、是無血清的2i/N2B27培養(yǎng)基:在N2B27中添加CHIR和PD03兩種小分子抑制劑(2i)。這兩種培養(yǎng)基通過不同的信號(hào)通路維持胚胎干細(xì)胞的自我更新，LIF/serum主要是通過LIF/STAT3信號(hào)通路。本課題組成員之前的研究發(fā)現(xiàn):在眾多的LIF/STAT3信號(hào)通路的靶基因中，Tfcp2l1是唯一下調(diào)之后導(dǎo)致LIF/serum培養(yǎng)條件下的小鼠胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)分化的基因。這說明了在LIF/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)mESCs自我更新的過程中

4、Tfcp2l1占有極其重要的位置。并且人們后來又發(fā)現(xiàn)同時(shí)過表達(dá)Tfcp2l1和klf2可以替代2i維持小鼠胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，所以Tfcp2l1作為多條通路的共同靶基因扮演了十分特殊的角色，但是Tfcp2l1作用的具體機(jī)制還不是很清楚。
　　為了探究Tfcp2l1在mESCs中調(diào)控自我更新的具體機(jī)制，我們首先在細(xì)胞中下調(diào)Tfcp2l1的表達(dá)量，檢測(cè)各個(gè)胚層的基因表達(dá)，查看其影響了向哪些胚層的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)胚層(endoder

5、m)、中胚層（mesoderm）和滋養(yǎng)層（trophectoderm）的基因發(fā)生了明顯的上調(diào)。為了反向驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，我們使用可經(jīng)DOX誘導(dǎo)過表達(dá)Tfcp2l1的細(xì)胞株i-Tfcp2l1進(jìn)行了擬胚體(EB)分化，結(jié)果顯示:在EB形成過程中，誘導(dǎo)Tfcp2l1的表達(dá)可以抑制mESCs向內(nèi)胚層、中胚層和滋養(yǎng)層方向分化。這些研究結(jié)果表明Tfcp2l1抑制mESCs向中內(nèi)胚層以及滋養(yǎng)層細(xì)胞方向分化。
　　TFCP2L1蛋白結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮作用的

6、基礎(chǔ)，于是我們通過實(shí)驗(yàn)分析了TFCP2L1蛋白不同結(jié)構(gòu)域在維持mESCs自我更新方面的作用。首先我們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上把TFCP2L1蛋白劃分成了四個(gè)結(jié)構(gòu)域:N-terminus(aa1-20)、CP2-like domain(aa21-242)、SAM domain(aa310-376)和C-terminus(aa377-480)。我們把這些片段一一缺失，構(gòu)建了四個(gè)過表達(dá)缺失突變蛋白的mESCs細(xì)胞株(△NT、△CP2、△SAM、△C

7、T)進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示△NT和△CP2細(xì)胞株不能在無LIF條件下維持自我更新。緊接著我們也進(jìn)行了mEpiSCs（mouse epiblast stem cells，mEpiSCs）重編程回到na(i)ve多能性狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)△NT和△CP2突變體不能或極少的使mEpiSCs重編程回na(i)ve狀態(tài)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了N-terminus和CP2-like domain對(duì)于Tfcp2l1維持mESCs的na(i)ve多能性非常重要

8、。
　　我們?cè)谂囵B(yǎng)缺失突變細(xì)胞株的過程中發(fā)現(xiàn)△NT和△CP2細(xì)胞株在正常LIF/serum培養(yǎng)條件下出現(xiàn)了微分化，進(jìn)一步的qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)△CP2細(xì)胞株存在比較高的內(nèi)胚層基因（Gata4和Gata6）的表達(dá);△NT細(xì)胞株則表達(dá)了較高的中胚層（T和Mixl）和滋養(yǎng)層的基因(Cdx2和Gata3)。于是我們便尋找導(dǎo)致細(xì)胞分化的原因，借以探究Tfcp2l1抑制mESCs向中胚層和滋養(yǎng)層分化的機(jī)制。經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)我們證明了△NT細(xì)

9、胞株向中胚層和滋養(yǎng)層方向分化是由Lef1上調(diào)表達(dá)引起的，即Tfcp2l1通過抑制Lef1的表達(dá)來抑制中胚層和滋養(yǎng)層基因的出現(xiàn)。
　　那么Tfcp2l1對(duì)于內(nèi)胚層基因的調(diào)節(jié)又是通過怎樣的途徑呢，我們查找資料后發(fā)現(xiàn)，MTA家族基因或許起著非常重要的作用。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MTA家族基因中只有Mta1的下調(diào)可以導(dǎo)致過表達(dá)Tfcp2l1的mESCs分化，并且是向內(nèi)胚層方向分化。反之，過表達(dá)Mta1能夠延緩mESCs分化。免疫共沉淀進(jìn)一步證明