2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是從早期囊胚中的內細胞團(Inner cell mass,ICM)細胞分離而得到的。在適宜的體外培養(yǎng)個條件下,能夠無限制的進行自我復制式的增值即自我更新,通過合適的誘導條件還能夠分化成來源于內、中、外三個胚層的各種類型細胞的能力,即多項分化的潛能[1-3]。由于小鼠胚胎干細胞具有的這些特性,使其成為研究發(fā)育生物學的理想原材料和疾病模型構建的重要材料。因此,

2、具有重大的經濟和社會價值。早期分離得到的小鼠胚胎干細胞需要培養(yǎng)在滅活的飼養(yǎng)層細胞(Mouse embryonicfibroblasts,MEFs)上,并添加含胎牛血清的培養(yǎng)基[1]。對于胚胎干細胞的研究,其中一個重要的內容就是在體外培養(yǎng)的條件下如何去維持其處在多能性的狀態(tài)。經過大量研究人員的不斷探索目前已經建立起了LIF/血清(FBS)培養(yǎng)體系,無血清的N2B27培養(yǎng)體系以及2i[3]培養(yǎng)體系等適合不同胚胎干細胞的體外培養(yǎng)體系。研究胚胎

3、干細胞在體外培養(yǎng)的條件下如何能夠維持在自我更新的狀態(tài)而不分化,就要對其維持自我更新的分子機制進行研究。經過研究人員的不懈努力,已經篩選和鑒定出了一些維持小鼠胚胎干細胞自我更新的關鍵調節(jié)基因[4]如:Tfcp2l1,Nanog, Esrrb,Sox2等,信號通路如:LIF/STAT3,WNT/β-catenin等。雖然這些信號通路和基因已經篩選出來,但是胚胎干細胞的調節(jié)是各種基因和信號通路相互作用的復雜過程。目前對于胚胎干細胞如何維持自我

4、更新而不出現(xiàn)分化的分子機制仍然不清楚。因此,需要將細胞學和生物化學以及分子生物學相結合,進一步對胚胎干細胞進行研究,探究其自我更新和分化的調節(jié)機制[5]。
  前期已經有文獻報道,Id基因家族的成員在無血清的N2B27培養(yǎng)條件下是BMP4/SMAD信號通路的下游基因,過表達后可以部分的代替BMP4的作用來維持小鼠胚胎干細胞的干性[6]。但是,Id基因家族維持mESCs自我更新的機制仍然不清楚。先前有文獻報道Id1基因在含血清的培養(yǎng)

5、基中能夠部分的代替LIF的作用,通過上調Nanog基因的表達來維持mESCs的自我更新,同時對于中胚層的標志基因T的表達也具有一定的抑制作用[7]。但是,對于Id基因家族的另外兩個成員Id2,Id3在mESCs中所發(fā)揮的作用并沒有報道。因此,本課題主要研究Id2和Id3在mESCs的作用。Id家族表達的蛋白具有螺旋-環(huán),螺旋(helix-loop-helix,HLH)結構域,對于細胞的遷移與周期發(fā)生具有促進的作用,同時又能夠抑制多種前體

6、的分化,延緩細胞的衰老[8]。因此,其對于胚胎干細胞干性的維持可能具有一定的作用。
  為了研究Id2和Id3這兩個基因在mESCs中的作用,我們首先過表達這兩個基因,利用相關的生物學軟件設計引物并大量擴增所需要的基因片段。驗證結果正確后,借助脂質體的特性將重組質粒轉染到mESCs中。經過篩選與驗證,確定正確的能夠穩(wěn)定遺傳的過表達細胞系。我們將建立的過表達細胞系培養(yǎng)在不含有LIF的血清培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)。一段時間后發(fā)現(xiàn)過表達的細胞

7、株仍然具有胚胎干細胞的形態(tài),而對照組細胞出現(xiàn)死亡或者已經分化。接著我們對胚胎干細胞的標志性基因(如:Nanog、Oct4、Esrrb、Tfcp2l1等)進行驗證。結果顯示:過表達Id2或者Id3的細胞系Nanog和Oct4的免疫熒光呈陽性,且多能性的標志堿性磷酸酶染色(AP)也成陽性,而對照組均為陰性。通過對檢測結果的分析,過表達后的細胞仍然維持在多能性的狀態(tài),而且Id2過表達的細胞與Id3過表達的細胞相比,產生更多的AP陽性克隆,說明

8、其促進自我更新的作用優(yōu)于Id3。因此,我們后續(xù)主要對Id2基因進行研究。接著我們通過shRNA的方法下調Id2基因的表達。結果顯示:下調后的細胞出現(xiàn)了分化,不能維持胚胎干細胞的形態(tài),說明Id2對mESCs干性的維持是非常重要的。隨后,我們使用轉錄組測序技術篩選Id2調控的下游靶基因。測序結果顯示:實驗組和對照組進行比較,有許多基因的表達量發(fā)生了變化。通過進一步的篩選,我們發(fā)現(xiàn)與胚胎干細胞多能性維持具有相關作用的c-Myc和n-Myc這兩

9、個轉錄因子的表達上調。接著我們通過在轉錄水平和翻譯水平對測序結果進行驗證,結果與測序一致。最后,我們對經過分析后所選擇的靶基因進行功能性驗證。在過表達Id2的細胞系中,下調c-Myc和n-Myc的表達,結果顯示:下調后胚胎干細胞出現(xiàn)了分化。在下調Id2表達的細胞系中,分別過表達c-Myc和n-Myc,結果顯示:過表達c-Myc和n-Myc后能夠對下調Id2后導致的細胞分化具有一定的削弱作用。
  綜上所述,我們的研究結果表明,過表

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