Numb基因過表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建與驗(yàn)證.pdf

1、目的：
　　Numb是重要的細(xì)胞命運(yùn)決定子，在決定人胚胎干細(xì)胞的分裂方式中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)用含有人Numb基因的慢病毒，感染人胚胎干細(xì)胞，建立人Numb基因過表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究人Numb基因調(diào)控干細(xì)胞“干性”的研究提供實(shí)驗(yàn)素材。
　　方法：
　　1、采用本實(shí)驗(yàn)室之前成功構(gòu)建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-puro慢病毒載體感染 hESC，經(jīng)藥選后建立含有調(diào)控組分的細(xì)胞系。再將Lenti-E

2、F1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒載體感染rtTA過表達(dá)胚胎干細(xì)胞，從而構(gòu)建完整的四環(huán)素調(diào)控人Numb過表達(dá)的hESCs細(xì)胞系。
　　2、采用本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒載體感染hESCs，建立EGFP過表達(dá)細(xì)胞系。根據(jù)EGFP所發(fā)的綠色熒光挑取Numb過表達(dá)的hESC克隆并純化，提取純化后的細(xì)胞的DNA，通過RT-PCR檢測(cè)Numb是否成功整合至hESC。并使用DOX誘導(dǎo)后通

3、過Q-PCR檢測(cè)Numb的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。?）成功建立人Numb基因過表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞系，熒光顯微鏡下可見發(fā)綠色熒光克隆。
　?。?）通過 RT-PCR檢測(cè)人 Numb基因過表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞系的NumbDNA，結(jié)果顯示23號(hào)和44號(hào)克隆在Maker的Numb基因分子大小處有明顯條帶。
　　（3）比較DOX誘導(dǎo)組（實(shí)驗(yàn)組）和未加DOX誘導(dǎo)組（CON組/對(duì)照組）的23號(hào)和44號(hào)克隆的Numb的表達(dá)。Q