小檗堿及8-羥基二氫小檗堿在小腸吸收機(jī)制的比較研究.pdf

1、小檗堿(Berberine,以下簡(jiǎn)稱Ber)是一種異喹啉類生物堿，在臨床上用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾。十幾年來，大量研究表明，Ber能明顯減輕Ⅱ型糖尿病患者的癥狀，調(diào)節(jié)患者的血糖和血脂。然而，Ber用于降血糖時(shí),劑量過大。對(duì)Ber進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)其8位羥基取代化合物（以下簡(jiǎn)稱BerH）對(duì)Ⅱ型糖尿病模型大鼠療效均顯著優(yōu)于Ber組，且劑量較Ber低1個(gè)數(shù)量級(jí)。前期研究中采用大鼠在體灌流技術(shù)比較研究Ber與BerH在小腸吸收情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2、明：Ber引入羥基后，腸吸收量大幅度增加。Caco-2細(xì)胞模型用于研究藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)操作方法簡(jiǎn)便易行,且重復(fù)性好，是目前國(guó)外廣泛采用的一種藥物腸吸收體外模型。因此，為了闡明BerH的腸道吸收機(jī)制，本課題從兩方面著手：一是根據(jù)藥典采用槳法比較研究二者的溶解及溶出性能；二是采用Caco-2細(xì)胞模型比較研究二者跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)包括三個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：時(shí)間及濃度依賴、轉(zhuǎn)運(yùn)能量依賴試驗(yàn)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介入試驗(yàn)；采用HPLC法測(cè)定藥物含量，計(jì)算并比較跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

3、參數(shù)表觀滲透系數(shù)Papp與外排率ER值，以期考察BerH的開發(fā)前景。主要內(nèi)容如下：
　　 1 Ber與BerH在水溶液中的溶解及溶出性能考察根據(jù)藥典采用槳法，于37℃，考察研究Ber與BerH在水溶液中的溶解及溶出性能，分別于不同時(shí)間段（15、30、45、60、90、120min）取樣，HPLC法測(cè)定藥物溶解量，并繪制溶解速率曲線及溶出度曲線。結(jié)果顯示：37℃，Ber達(dá)溶解平衡時(shí)間為30min左右，而BerH需要90min；達(dá)溶

4、解平衡時(shí)，Ber濃度在45μmol/L左右，BerH在0.35μmol/L，Ber本身已是難溶性的藥物，而由結(jié)果得知BerH的溶解速率及溶出度遠(yuǎn)小于Ber，表明BerH極難溶于水。
　　 2 時(shí)間及濃度依賴性吸收試驗(yàn)通過Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，于37℃，考察不同時(shí)間段（0.5、1.0、1.5、2.0h），不同濃度（25、50μmol/L）Ber、BerH從AP→BL及BL→AP方向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，AP側(cè)給藥為吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),BL

5、側(cè)給藥為外流實(shí)驗(yàn)，HPLC法測(cè)定二者跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量。結(jié)果顯示：BerH高、低濃度組的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)表觀滲透系數(shù)（Papp）皆在10-5數(shù)量級(jí)，提示BerH為良好轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物；而Ber高、低濃度組皆在10-6數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)小于BerH，說明BerH的膜通透性明顯高于Ber；Ber在50、25μmol/L時(shí)AP→BL方向的Papp較為接近且隨時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化；而BerH在50、25μmol/L時(shí)AP→BL方向的Papp差別較大，低濃度時(shí)的Papp是高

6、濃度時(shí)的三倍左右，說明BerH、Ber跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)都不依賴化合物的濃度，初步確定二者跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程為非簡(jiǎn)單擴(kuò)散，可能有載體介入轉(zhuǎn)運(yùn)，但有差別。
　　 3 能量依賴性吸收試驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞單層膜,加入ATP能量衰竭劑(迭氮鈉及脫氧葡萄糖),AP側(cè)和BL側(cè)分別給藥與取樣,HPLC法測(cè)定跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組表觀滲透系數(shù)Papp與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），迭氮鈉和2-脫氧-D-葡萄糖可抑制Ber和BerH通過Cac

7、o-2細(xì)胞單層膜的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，表明Ber、BerH通過Caco-2細(xì)胞單層膜的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)均需要消耗能量,推測(cè)ATP結(jié)合的盒式膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可能介入了BerH的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
　　 4 P-gp抑制劑維拉帕米及有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑西咪替丁影響試驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞模型，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米及有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑西咪替丁，分別于AP和BL側(cè)給藥,考察轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)Ber、BerH跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果顯示：維拉帕米組

8、表觀滲透系數(shù)Papp和對(duì)照組比較差異具有顯著性（P＜0.05），維拉帕米增大BerH AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp，同時(shí)減少BerH BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，且在60min時(shí)最為明顯；而維拉帕米僅在60min后增加Ber AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp，降低Ber BL→AP方向的表觀滲透系數(shù)Papp，且變化幅度遠(yuǎn)小于BerH；加入西咪替丁后，Ber與BerH AP→BL方向的表觀滲透系數(shù)Papp與對(duì)照組比較

9、無顯著性差異（P>0.05），由此可推測(cè)BerH與Ber一樣，在Caco-2細(xì)胞單層膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)存在P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排作用，且BerH對(duì)P－gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排作用反應(yīng)更加敏感，但二者都不依賴有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　 綜上所述，本文通過比較研究二者在水中的溶解及溶出性能，確定了BerH溶解度及溶出速度顯著低于Ber，說明Ber結(jié)構(gòu)引入羥基后并沒有增加親水性，否定了BerH較Ber易吸收機(jī)理是因?yàn)槿芙饧叭艹鲂阅艿脑黾?。在此基礎(chǔ)上

10、進(jìn)一步建立Caco-2細(xì)胞模型并考察比較Ber及BerH跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)異同得出：二者的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程均為非簡(jiǎn)單擴(kuò)散，都存在P-gp外排作用且否定BerH依賴有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；另外，由二者的單純擴(kuò)散系數(shù)比較得出BerH的膜通透性良好，遠(yuǎn)優(yōu)于Ber，這可用于解釋前期動(dòng)物模型研究中BerH腸吸收的增加；另外，相對(duì)于Ber，BerH對(duì)P-gp反應(yīng)更加敏感，這提示P-gp在BerH的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)中作用更加顯著，因此在該化合物劑型開發(fā)的過程中可考慮選擇具