小檗堿對心肌肥厚及纖維化的作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　 心肌肥厚與纖維化是心臟長期負荷過重時發(fā)生的一種心室重構，除心肌細胞蛋白質合成增加和細胞體積增大外，還伴隨心肌細胞間結締組織沉積。心肌肥厚也是多種心血管系統(tǒng)疾病的常見并發(fā)癥和病理基礎，常導致嚴重的心律失常、心力衰竭，預防與逆轉這種改變是治療的重要目標。
　　 磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種在細胞內行使能量代謝調節(jié)的蛋白激酶。目前對A

2、MPK的研究主要集中在能量代謝調節(jié)方面，且在糖尿病及肥胖癥等人類代謝性疾病的發(fā)病中發(fā)揮著至關重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK基因突變可導致心肌肥大及心律失常，以及AMPK的激活可通過負性調節(jié)mTOR/ p70S6K通路減輕由壓力負荷過度誘發(fā)的的心肌肥厚與纖維化。因此AMPK有望成為心肌肥厚與纖維化疾病中的治療新靶點。
　　 小檗堿（Berberine，BBR），一種天然異喹啉類生物堿，作為清熱解毒藥和抗菌藥應用于臨床已有很長

3、的歷史。隨著對小檗堿的深入研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿在糖尿病、代謝性疾病、心血管疾病中具有廣泛的藥理作用，表現(xiàn)為抗動脈粥樣硬化、抗Ⅱ型糖尿病、對抗肥胖癥、對心臟的正向肌力作用、抗心律失常、擴張血管降壓、抗心肌缺血等。大量的機制研究發(fā)現(xiàn)，其主要是通過激活AMPK而起作用。鑒于AMPK在心肌肥厚及纖維化中的作用，我們推測小檗堿可能通過激活AMPK抑制心肌肥厚及纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 在心臟中，AMPKα2是其主要的催化亞基，我們應用AMPK

4、α2基因敲除小鼠，擬在壓力負荷過度誘發(fā)的的小鼠心肌肥厚與纖維化模型基礎上，研究Berberine對心肌肥厚與纖維化的作用，同時進行體外細胞實驗研究，闡明小檗堿對壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚及纖維化的作用、作用靶點及相關分子機制。希望能為小檗堿治療心肌肥厚及纖維化提供科學的理論依據(jù)，同時為心肌肥厚與纖維化疾病的治療提供新的治療靶點。
　　 目的：
　　 獲得Berberine抑制心肌肥厚及纖維化的可靠證據(jù)，并闡明其作用機制，

5、為AMPK作為心肌肥厚及纖維化治療的新靶點提供充分的科學依據(jù)，同時為Berberine作為心肌肥厚及纖維化治療提供充分的理論研究。
　　 方法：
　　 1Berberine對PE誘導的心肌細胞肥大作用的研究
　　 培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，用不同濃度（0, 5, 10, 20, 30mM）Berberine預處理心肌細胞60min后，用100mM PE（phenylephrine，苯腎上腺素）處理心肌細胞0, 6,

6、12, 24,48h。采用[3H]-亮氨酸摻入法、計算心肌細胞面積、real-time PCR檢測心肌細胞肥大標志物心房鈉尿肽（AtriAlnatriuretic peptide， ANP）、B型利鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，評價各組心肌細胞肥大的情況，篩選最佳的用藥劑量濃度及作用時間。
　　 2 Berberine對AB誘導的野生型小鼠心肌肥厚及纖維化作用的研究
　　 選取8周

7、齡、體重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠，以胸主動脈縮窄誘導小鼠心肌肥厚模型。實驗共分八組：Sham(假手術)組、AB(Aortic binding，主動脈縮窄術)模型組、Sham組+BBR（berberine）低中高劑量（40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg）組、AB模型組+BBR低中高劑量（40mg/kg、80mg/kg、100mg/kg）組，每組各20只。術后8w，超聲及血流動力學評價小鼠心臟功能；HE染色觀察

8、心臟大體組織和細胞橫切面積；PSR（Picrosirius red，天狼星紅染色）觀察心肌組織膠原；real-time PCR檢測心肌細胞肥大標志物ANP、BNP、肌球蛋白重鏈α(α-myosin heavy chain, α-MHC)、肌球蛋白重鏈β(β-myosin heavy chain, β-MHC），心肌纖維化標志物結締組織生長因子（Connective tissue growth factor， CTGF）、I型溶膠原α1(

9、Procollagen, type I，α1, CollagenI)、III型溶膠原α1(Procollagen, type III, α1, CollagenIII）的mRNA水平，評價Berberine對胸主動脈縮窄誘導小鼠心肌肥厚的作用，篩選藥物的最佳作用劑量。
　　 3 Berberine抑制心肌肥厚及纖維化分子機制的探討
　　 30mMBerberine預處理大鼠原代心肌細胞60min，用100mM PE處理心

10、肌細胞0,48h。8周齡、體重24-26g雄性C57BL/6野生型小鼠，以胸主動脈縮窄誘導小鼠心肌肥厚模型；實驗分四組：Sham(假手術)組、AB模型組、Sham組+BBR（berberine）（100mg/kg）組、AB模型組+BBR低（100mg/kg）組，每組各20只。Wetern blot 檢測AMPK相關信號通路總蛋白及磷酸化蛋白的表達水平。
　　 4 Berberine對AB誘導的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纖維

11、化作用的研究
　　 選取8周齡、體重24-26g雄性AMPKα2 Ko（knock out）小鼠，以胸主動脈縮窄誘導小鼠心肌肥厚模型。實驗共分四組：Sham(假手術)組、AB模型組、Sham組+BBR（100mg/kg）組、AB模型組+BB（100mg/kg）組，每組各20只。術后4w，超聲及血流動力學評價小鼠心臟功能；HE染色觀察心臟大體組織和細胞橫切面積；PSR觀察心肌組織膠原；real-time PCR檢測心肌細胞肥大標志

12、物ANP、BNP、α-MHC、β-MHC、膽固醇?；D移酶1（acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1, Acat1）、血管緊張素Ⅱ受體1亞型(angiotensin 2 receptor, type 1, AT1)、GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4)、肌細胞增強因子2C (myocyte enhancer factor 2C， Mef2c)、鈣神經素1調節(jié)

13、劑(regulator of calcineurin 1, MCIP1.4、肌漿網鈣ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase， SERCA2a)、血管緊張素1轉換酶(angiotensin I converting enzyme， ACE）以及纖維化標志物轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)、轉化生長因子β2(transforming gr

14、owth factor β2, TGFβ2)、Collagen I、Collagen Ⅲ、CTGF、纖維連接素(Fibronection, FN)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase2, MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase9, MMP-9)、骨橋蛋白(osteopontin， OPN)。
　　 結果：
　　 1Berberine對PE誘導的心肌細

15、胞肥大作用的探討
　　 細胞實驗結果表明，Berberine能夠減少PE誘導后的原代大鼠心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入量的增多、心肌細胞面積的增大、心肌細胞肥大標志物ANP、BNP的升高，且成劑量依賴性，30mM時作用最為明顯。表明Berberine能夠抑制PE誘導的心肌細胞肥大。
　　 2 Berberine對AB誘導的野生型小鼠心肌肥厚及纖維化作用的影響
　　 超聲及血流動力學結果顯示，模型組中，左室舒張末期內

16、徑（Left ventricμlar end-diastolic dimension， LVEDD）、左室收縮末期內徑(Left ventricμlar end-systolic dimension， LVESD)、左室后壁厚度(Left ventricμlus posterior wall dimension， LVPWd顯著升高（P<0.05），而短軸縮短率(FractionAlshortening， FS)顯著下降（P<0.05）

17、，給予Berberine治療后LVEDD、LVESD、LVPWd顯著降低（P<0.05），而FS顯著升高（P<0.05），其中高劑量組（100mg/kg）組最為顯著；病理染色結果顯示：模型組中，心肌細胞面積顯著增大（p<0.05）、心肌組織膠原明顯增多（p<0.05），給予Berberine治療后，心肌細胞面積顯著減?。╬<0.05）、心肌組織膠原明顯增少（p<0.05）；real-time PCR檢測結果顯示，模型組中心肌細胞肥大標志

18、物（ANP、BNP、α-MHC、β-MHC）、心肌纖維化標志物（CTGF、CollagenI、CollagenIII）的mRNA水平明顯上升，給予Berberine治療后，心肌細胞肥大標志物（ANP、BNP、β-MHC）、心肌纖維化標志物（CTGF、CollagenI、CollagenIII）的mRNA水平明顯下降。表明berberine能顯著抑制由胸主動脈誘導的心肌肥厚。
　　 3 Berberine抑制心肌肥厚及纖維化的分子

19、機制
　　 Western blot 檢測結果表明，在PE誘導的大鼠心肌細胞肥大模型中及主動脈縮窄誘導的小鼠心肌肥厚模型中，AMPK、ACC、mTOR、p70S6K及eEF2的總蛋白無變化，而它們的磷酸化水平p-AMPK、p-ACC ser79、p-mTOR、p-p70S6Kthr389顯著上調（P<0.05），p-eEF2thr56顯著下調（P<0.05），表明在PE誘導的大鼠心肌細胞肥大模型中及主動脈縮窄誘導的小鼠心肌肥厚模

20、型中，AMPK及mTOR/70S6K信號通路被激活；應用Berberine干預后，與模型組相比較，AMPK、ACC、mTOR、70S6K及eEF2的總蛋白無變化，磷酸化水平p-AMPK、p-ACCser79、p-eEF2 thr56顯著上調（P<0.05），而p-mTOR、p-70S6K thr389顯著下調（P<0.05），表明Berberine可進一步激活AMPK，負性調節(jié)mTOR/70S6K信號通路。
　　 4 Berbe

21、rine對AB誘導的AMPKα2 Ko小鼠心肌肥厚及纖維化作用
　　 超聲及血流動力學結果顯示，模型組中， LVEDD、LVESD、LVPWd顯著升高（P<0.05），而FS顯著下降（P<0.05），給予Berberine干預后LVEDD、LVESD、LVPWd、 FS無顯著變化（P>0.05）；病理染色結果顯示：模型組中，心肌細胞面積顯著增大（p<0.05）、心肌組織膠原明顯增多（p<0.05）；給予Berberine干預后，

22、心肌細胞面積、心肌組織膠原無顯著改變（P>0.05）；real-time PCR檢測結果顯示，模型組中心肌細胞肥大標志物（ANP、BNP、β-MHC、Acat1、Mcip1.4、ACE、GATA4、Mef2c）的mRNA水平顯著升高（p<0.05），AT1、SERCA2a顯著降低（p<0.05），以及纖維化指標（TGFβ1、TGFβ2、Collagen I、Collagen Ⅲ、CTGF、Fibronection、MMP-2、MMP-9