抑瘤基因NGX6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：
　　 結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率以及死亡率呈逐年上升趨勢。目前結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明，許多結(jié)直腸癌相關(guān)基因未被發(fā)現(xiàn)。尋找新的結(jié)直腸癌相關(guān)的抑瘤基因或易感基因，對(duì)其功能進(jìn)行研究，以期找到更多的影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因或比較特異的分子標(biāo)志物，確定結(jié)直腸癌的遺傳易感因素，闡明其發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后監(jiān)測以及新的抗腫瘤藥物的研制都具有重要意義。
　　

2、 NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室采用定位侯選克隆策略克隆的一個(gè)抑癌基因(基因登陸號(hào)：AF188239)，定位于染色體9p13.3區(qū)域。它在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)。前期研究表明：NGX6能通過抑制核內(nèi)β-catenin的表達(dá)負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，通過抑制P-JNK核移位負(fù)調(diào)控SPAK/JNK通路，并下調(diào)EGFR-PKC-IKK-NF-κ B通路的關(guān)鍵分子和轉(zhuǎn)錄因子。過表達(dá)NGX6基因可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增

3、殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制腫瘤血管的生成；降低腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力，同時(shí)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間隙通訊。為了揭示NGX6基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制，本課題組前期對(duì)NGX6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行了初步研究。以NGX6基因mRNA的第一個(gè)堿基定義為+1，利用生物信息學(xué)分析技術(shù)、缺失突變體報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)以及熒光素酶活性分析系統(tǒng)，定位了NGX6基因的近距離啟動(dòng)子區(qū)-159/+276，并發(fā)現(xiàn)NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)大小為約400bp的Cp

4、G島。
　　 本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)NGX6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行深入研究，希望從調(diào)控該基因表達(dá)的上游基因的角度，明確該基因具體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以進(jìn)一步揭示NGX6基因在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，深入闡明NGX6基因的生物學(xué)功能。
　　 [NGX6基因啟動(dòng)子的精細(xì)定位]
　　 在前期的研究工作中，我們成功克隆并鑒定了NGX6基因啟動(dòng)子，并將NGX6基因的近距離啟動(dòng)子區(qū)定位于-159/+276的區(qū)域。為了

5、進(jìn)一步獲得NGX6基因的最小啟動(dòng)子序列，依據(jù)MatInspector軟件分析結(jié)果，分別在其近距離啟動(dòng)子片段-159/+276的5’或3’進(jìn)行缺失不同長度的部分序列，構(gòu)建了五個(gè)缺失突變報(bào)告質(zhì)粒：pGL3-159/+100、pGL3+100/+276、pGL3-159/-86、pGL3-86/+12和pGL3+12/+100。將它們分別轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系中，采用熒光素酶活性檢測和綠色熒光蛋白活體檢測法發(fā)現(xiàn)NGX6基因-86/+100的長度為18

6、6 bp的區(qū)域?yàn)槠渥钚?dòng)子區(qū)。
　　 [NGX6基因啟動(dòng)子順式作用元件和反式作用因子的鑒定和功能研究]
　　 真核基因表達(dá)調(diào)控體系中最關(guān)鍵的是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控，其基本機(jī)制主要包括順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用，其實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。在線軟件MatInspector分析結(jié)果表明，NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)為一個(gè)不含TATA盒，而含有CAAT盒的GC富集區(qū)。它含有

7、多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如：Sp1、Egr-1、NF-Y、P53、MYC-MAX和AP2等。凝膠電泳遷移率(EMSA)證實(shí)了NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)的Sp1(-17/+5)、NF-Y(-36/-18)以及Sp1/Egr(-54/-39)結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Egr-1與NGX6基因啟動(dòng)子的特異性結(jié)合。
　　 本課題組成功構(gòu)建了核轉(zhuǎn)錄因子Egr-1和Sp1真核表達(dá)載體。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，過表達(dá)Eg

8、r-1能增強(qiáng)NGX6基因啟動(dòng)子活性并上調(diào)NGX6基因的內(nèi)源性mRNA表達(dá)；而封閉內(nèi)源性Egr-1的表達(dá)則抑制了NGX6基因內(nèi)源性mRNA的表達(dá)水平。此外，Erk1/2激酶的抑制劑PD98059可以明顯下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中Egr-1和NGX6表達(dá)水平，EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)PD98059可能通過降低細(xì)胞核內(nèi)Egr-1蛋白與DNA的結(jié)合活性，進(jìn)而抑制了NGX6基因的表達(dá)。這些結(jié)果說明，核轉(zhuǎn)錄因子Egr-1是正性調(diào)控NGX6基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因

9、子Sp1能在結(jié)腸癌細(xì)胞中上調(diào)NGX6基因啟動(dòng)子活性；封閉內(nèi)源性Sp1的表達(dá)可以明顯上調(diào)NGX6基因內(nèi)源性。mRNA的表達(dá)水平。這些結(jié)果說明核轉(zhuǎn)錄因子Sp1也是正性調(diào)控NGX6基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 [DNA甲基化抑制NGX6基因的表達(dá)，去甲基化能恢復(fù)其表達(dá)]
　　 在前期研究中，利用CpGplot和CpGFinder程序在線掃描NGX6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，發(fā)現(xiàn)NGX6的啟動(dòng)子區(qū)-107/+310存在一個(gè)CpG島。Refgene

10、數(shù)據(jù)庫中也搜索到在NGX6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在CG頻率較高的區(qū)域。利用Methylator軟件(http：//bio.dfci.harvard.edu/Methylator/)對(duì)NGX6啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了預(yù)測分析。分析結(jié)果顯示在NGX6基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)甲基化位點(diǎn)，提示NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)的這一CpG島可能是其啟動(dòng)子活性調(diào)節(jié)的重要調(diào)控元件。利用NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)特異性甲基化和非甲基化引物進(jìn)行了甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)NGX6啟

11、動(dòng)子在三株結(jié)腸癌細(xì)胞系中都呈部分甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步在結(jié)直腸癌組織水平上進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示NGX6啟動(dòng)子在40例結(jié)直腸癌組織中的甲基化水平明顯高于40例正常結(jié)直腸組織(P<0.05)。將結(jié)直腸癌組織中NGX6基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病例特征進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中，NGX6基因啟動(dòng)子甲基化頻率與患者的年齡相關(guān)(P<0.05)；NGX6基因啟動(dòng)子甲基化頻率與結(jié)直腸轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性趨勢(P=0.056)；而與患者的性別

12、、Duke's分期、腫瘤部位無明顯相關(guān)(P>0.05)。亞硫酸鹽修飾后測序法的結(jié)果表明NGX6基因啟動(dòng)子-233/+150存在多個(gè)甲基化位點(diǎn)，其中涉及-54/-39的Sp1與Egr-1重疊結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)位于-17/+5的Sp1結(jié)合位點(diǎn)。利用SssI甲基轉(zhuǎn)移酶能將腺苷甲硫氨酸中的甲基轉(zhuǎn)移至基因組DNA的CpG位點(diǎn)的非甲基化胞嘧啶“C”上，使原本未甲基化的“C”發(fā)生甲基化的特點(diǎn)，選擇性地處理了對(duì)NGX6基因啟動(dòng)子活性調(diào)節(jié)起重要作用的Sp1/

13、Egr-1重疊結(jié)合位點(diǎn)-54/-39的生物素標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸探針，并進(jìn)行了凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在Sp1/Egr-1重疊結(jié)合位點(diǎn)DNA甲基化完全抑制了Egr-1核蛋白與DNA的結(jié)合，部分抑制了Sp1核蛋白與DNA的結(jié)合。同樣，將NGX6基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-159/+100和綠色熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒pGL3-159/+100/GFP經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理后，發(fā)現(xiàn)他們在結(jié)腸癌細(xì)胞中喪失了啟動(dòng)子活性。2.5μM的甲基化轉(zhuǎn)移酶

14、抑制劑5.脫氧雜氮胞苷能夠逆轉(zhuǎn)NGX6基因啟動(dòng)子在HT-29細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，并上調(diào)NGX6基因mRNA表達(dá)水平。
　　 總之，通過本課題研究，我們獲得了NGX6基因啟動(dòng)子的精細(xì)位置，較系統(tǒng)地闡述了NGX6啟動(dòng)子順式作用元件和反式作用因子的組成和功能，探索了DNA甲基化對(duì)NGX6基因啟動(dòng)子活性、mRNA表達(dá)水平的影響及分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)。NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化參與NGX6基因在結(jié)直腸組織的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且NGX6基因啟動(dòng)子區(qū)