快速免疫組化法鑒別人體周圍神經(jīng)感覺纖維的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:周圍神經(jīng)中含有感覺神經(jīng)纖維和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維兩種成分,神經(jīng)的功能是由這兩種神經(jīng)纖維的比例所決定的。在神經(jīng)干中神經(jīng)纖維并不是單獨(dú)行走的,它們彼此組合,被神經(jīng)束膜分隔成相對(duì)獨(dú)立的神經(jīng)束,對(duì)神經(jīng)干內(nèi)神經(jīng)束分布規(guī)律及性質(zhì)的判斷,可以指導(dǎo)臨床進(jìn)行手術(shù)方法的選擇。目前區(qū)別神經(jīng)束的各種方法,因?yàn)楦髯缘牟蛔闩c缺陷難以應(yīng)用于臨床。自1970年以來(lái),人們相繼發(fā)現(xiàn)了多種神經(jīng)元特異性蛋白,在免疫組織化學(xué)等方法的幫助下,人們對(duì)神經(jīng)元的產(chǎn)生及生長(zhǎng)過程有了更多的了

2、解。免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry),是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)的抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。免疫組織化學(xué)技術(shù)具有特異性強(qiáng),快速等優(yōu)點(diǎn),但是應(yīng)用此技術(shù)鑒別周圍神經(jīng)的關(guān)鍵是如何確定感覺神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)特

3、有的標(biāo)志物。膜聯(lián)蛋白(Annexin V)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白,分子量約為35KD,它具有抗凝、抗炎、鈣離子通道等作用。據(jù)目前研究Annexin V主要分布在周圍神經(jīng)中的感覺神經(jīng)軸突,在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)中尚未有發(fā)現(xiàn)的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)膜聯(lián)蛋白V在周圍神經(jīng)中特性,并應(yīng)用這種特性鑒別人周圍神經(jīng)感覺束與運(yùn)動(dòng)束,希望達(dá)到證實(shí)臨床應(yīng)用快速免疫組化法鑒別人周圍神經(jīng)功能束具有可行性目的,從而構(gòu)建科學(xué)實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用之間的橋梁。<

4、br>　　 方法:實(shí)驗(yàn)1選正常健康雄性SD大鼠30只,體重250±10g,取大鼠脊神經(jīng)前根、后根各5mm,暴露并取坐骨神經(jīng)及其肌支、皮支各5mm,將上述組織立即做冰凍切片,片厚5μm,行SABC免疫組化法,神經(jīng)組織冰凍切片經(jīng)抗原-抗體反應(yīng)-抗體標(biāo)記-DAB顯色.蘇木精復(fù)染,脫片、透明、封片處理后,顯微鏡下觀察顏色。對(duì)照組采用替代試驗(yàn),即用PBS代替-抗,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。
　　 實(shí)驗(yàn)2取新鮮廢棄斷肢前臂尺神經(jīng)主干,尺神經(jīng)腕背支

5、(皮支)及正中神經(jīng)大魚際肌支各5mm,上述組織立即做冰凍切片,片厚5μm,行S-P免疫組化法,神經(jīng)組織切片經(jīng)抗原-抗體反應(yīng)-抗體標(biāo)記-DAB顯色-蘇木精復(fù)染,脫片、透明、封片處理后,顯微鏡下觀察顏色。對(duì)照組采用替代試驗(yàn),即用PBS代替-抗,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)ISD大鼠脊神經(jīng)根中,前根呈陰性反應(yīng),后根為陽(yáng)性反應(yīng),肌支以未染的神經(jīng)纖維為主,皮支以深染的神經(jīng)纖維為主,其中坐骨神經(jīng)內(nèi)既有深染的神經(jīng)纖維也有未染的神經(jīng)纖維

6、。對(duì)照組的神經(jīng)組織均呈陰性反應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)2正中神經(jīng)大魚際肌支以未染的神經(jīng)纖維為主,尺神經(jīng)腕背支以深染的神經(jīng)纖維為主,尺神經(jīng)主干內(nèi)既有深染的神經(jīng)纖維也有未染的神經(jīng)纖維,對(duì)照組的神經(jīng)組織均呈陰性反應(yīng)。
　　 結(jié)論:在遠(yuǎn)端神經(jīng)干內(nèi),神經(jīng)的各分支在干內(nèi)有明確的定位,即有特定的功能束存在,而在肢體近端,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束和感覺神經(jīng)束混合存在。在混合神經(jīng)中,各類纖維所占的比例亦有差異。如果某一類纖維所占比例較大,在再生軸索長(zhǎng)入遠(yuǎn)端神經(jīng)內(nèi)

7、膜管的過程中,將有更多的機(jī)會(huì)長(zhǎng)入相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)膜管,因而周圍神經(jīng)斷裂損傷后,在進(jìn)行神經(jīng)原位縫合或神經(jīng)移位、移植修復(fù)術(shù)時(shí),要求術(shù)者了解神經(jīng)干內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu),特別是神經(jīng)干內(nèi)神經(jīng)功能束的定位知識(shí),這樣才有可能達(dá)到精確的選擇性神經(jīng)束支對(duì)位縫合,減少再生纖維迷走所致的無(wú)效再生,提高術(shù)后肢體功能的恢復(fù)率。因此臨床需要一種快速、準(zhǔn)確鑒別周圍感覺神經(jīng)束和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束的方法,本實(shí)驗(yàn)通過膜聯(lián)蛋白V在周圍神經(jīng)組織中的特性,并將此種方法應(yīng)用于人體周圍神經(jīng),驗(yàn)證了此法