熱休克蛋白70參與恩必普預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是臨床上常見病、多發(fā)病之一，死亡率和致殘率均較高，嚴(yán)重危害著人類的健康。特別是神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損害非常敏感，長時(shí)間的缺血打擊使得神經(jīng)細(xì)胞大量死亡，難以再生，從而留下許多嚴(yán)重甚至是不可逆性的后遺癥。因此，調(diào)動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，提高神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損害的抵抗力，使其在蒙受較嚴(yán)重的缺血狀態(tài)下減輕損傷，保持存活，保證恢復(fù)血液供應(yīng)后這些神經(jīng)細(xì)胞仍具有正常生理功能，是缺血性腦血管病治療上的一個(gè)重要策略。1990年，日本學(xué)者K

2、itagiwa等首先發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予沙土鼠輕微、短時(shí)、不致引起神經(jīng)元死亡的腦缺血，可減輕再次損傷性缺血引起的CA1區(qū)神經(jīng)元死亡，此種現(xiàn)象稱為腦缺血耐受（brain ischemic tolerance），提前給予的亞致死性腦缺血稱為腦缺血預(yù)處理（brain ischemic preconditioning）。但是，這種操作很難作為一種腦缺血前的預(yù)防措施進(jìn)入臨床應(yīng)用，因此人們不斷探索新的有效的腦缺血預(yù)處理措施。研究表明，應(yīng)用藥物模擬或誘導(dǎo)一

3、些物質(zhì)如腺苷、HSP等的表達(dá)，可使神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損傷產(chǎn)生對抗作用。
　　 熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）亦稱應(yīng)激蛋白，是在生理或病理應(yīng)激狀態(tài)下于細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)，對應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用。其中分子量為70kd的HSP家族是最保守的HSP，其在正常細(xì)胞中水平較低，應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高，因而成為HSPs中最被關(guān)注、研究最深入的一種。作為非器官特異性應(yīng)激蛋白，HSP70可能有助于神經(jīng)元缺血耐受的形成。

4、r>　　 恩必普（Butylphhtalide或Dinbente，簡稱NBP）即消旋-3-正丁基苯酞軟膠囊是我國成功制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療急性缺血腦卒中的一類化學(xué)新藥。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型，觀察恩必普預(yù)處理對全腦缺血-再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響，探討恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察恩必普預(yù)處理后全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)情況，以及應(yīng)用HSP70合成抑制劑槲皮素對海馬

5、CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響，探討HSP70在恩必普預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷中的作用及恩必普腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、恩必普預(yù)處理對大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響
　　 應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型，36只大鼠椎動(dòng)脈凝閉后隨機(jī)分為4組：①Sham組（n=6）：游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不夾閉；②恩必普預(yù)處理組（n=6）：恩必普30mg/kg灌胃；③腦缺血組（n=6）：夾

6、閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min致全腦缺血；④恩必普預(yù)處理+腦缺血組：恩必普預(yù)處理后即刻、1d和2d行8min全腦缺血（共3組，每組n=6）。所有大鼠在sham手術(shù)或末次缺血再灌后7天，斷頭取腦，硫堇染色確定海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)（histological grade，HG）和神經(jīng)元密度（neuronal density，ND），以反映遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（delayed neuronal death，DND）情況。
　　 2、恩必普預(yù)處理

7、對缺血再灌注海馬HSP70表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型，90只椎動(dòng)脈永久凝閉的大鼠隨機(jī)分為3組。（1） sham組：下設(shè)五個(gè)亞組：分別為腦缺血sham手術(shù)后6h、12h、1d、3d、5d組（每組n=6）。（2）腦缺血組：全腦缺血8 min。下設(shè)五個(gè)亞組：分別為腦缺血后6h、12h、1d、3d、5d組（每組n=6）。（3）恩必普+腦缺血組：恩必普預(yù)處理1d后行全腦缺血8 min；下設(shè)五個(gè)亞組：分別為腦缺血后6h

8、、12h、1d、3d、5d組（每組n=6）。所有動(dòng)物于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)斷頭取材，石蠟包埋，連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)。
　　 3、HSP70抑制劑Quercetin對恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用的影響
　　 應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型，36只椎動(dòng)脈永久凝閉的大鼠隨機(jī)分為以下6組：（1） sham組行腦缺血sham手術(shù)（n=6）；（2）恩必普預(yù)處理組：恩必普灌胃30mg/kg（n=6）；（3）

9、腦缺血組：行全腦缺血8 min；（4）恩必普預(yù)處理+腦缺血組：恩必普預(yù)處理后1d行全腦缺血8 min；（5） Quercetin+恩必普+腦缺血組：恩必普預(yù)處理前30min及恩必普預(yù)處理后即刻、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分別給與HSP70抑制劑Quercetin（50 mg/kg，腹腔注射），其余同恩必普預(yù)處理+腦缺血組；（6） DMSO+恩必普+腦缺血組：腹腔注射3％的DMSO溶液4 mL/kg，注射時(shí)間及其它處理同Qu

10、ercetin+恩必普+腦缺血組。所有動(dòng)物均于末次手術(shù)后7天斷頭取材，硫堇染色確定海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)（histological grade，HG）和神經(jīng)元密度（neuronal density，ND），以反映遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（delayed neuronal death，DND）情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、恩必普預(yù)處理減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡
　　 硫堇染色結(jié)果表明

11、sham組和恩必普組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯損傷，組織學(xué)分級(jí)（histological grade，HG）為0～Ⅰ級(jí)，ND分別為193±8.6（cells/mm，下同）、196.8±12。腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)有明顯組織損傷；HG為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，ND為34.8±8.2，與sham組和恩必普組相比，HG明顯升高，ND明顯減少（p<0.01）。在恩必普預(yù)處理+腦缺血組，恩必普預(yù)處理后1d腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊致密，胞核飽滿，核

12、仁較清晰，僅個(gè)別錐體細(xì)胞胞核固縮，無明顯細(xì)胞缺失，與腦缺血組相比，HG（Ⅰ級(jí)）明顯降低，ND（165.3±9.3）明顯升高，表明恩必普預(yù)處理對其后1d發(fā)生的腦缺血再灌注損傷有明顯的對抗作用。恩必普預(yù)處理后即刻和2d進(jìn)行腦缺血再灌注，與腦缺血組比較，HG有一定程度降低，ND有一定程度升高（p<0.01），但大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失較多，仍有明顯的組織損傷。
　　 結(jié)果表明恩必普預(yù)處理能夠減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷引起的海馬CA

13、1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，這種作用在恩必普預(yù)處理后1d最為強(qiáng)大，而在預(yù)處理后即刻及2d對腦缺血再灌注損傷雖有一定的抑制作用，但作用強(qiáng)度明顯減弱。
　　 2、恩必普預(yù)處理上調(diào)腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)
　　 HSP70陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，多見于神經(jīng)元胞漿和軸突，有時(shí)可見于胞核。sham組海馬神經(jīng)元中少見明顯的HSP70蛋白表達(dá)。單純腦缺血組，CA1區(qū)于再灌注各時(shí)間點(diǎn)可見少量HSP70陽性表達(dá)；在CA3

14、、CA4區(qū)及齒狀回區(qū)可見大量HSP70陽性表達(dá)。在恩必普+腦缺血組，腦缺血再灌注6h海馬CA1區(qū)可見少量的HSP70表達(dá)，12hHSP70表達(dá)增加，再灌注1d后CA1區(qū)HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng)，數(shù)量增加，達(dá)到高峰，可見大量神經(jīng)元的胞漿及軸突呈棕黃色HSP70陽性染色；再灌注3d后CA1區(qū)HSP70表達(dá)維持在較高水平，但與1d組相比較已開始回落；再灌注5d仍可見到CA1區(qū)少量HSP70陽性表達(dá)。與sham組及TCI組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，再灌注后

15、12h、1d、3d、5d海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞總面積和平均光密度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。恩必普預(yù)處理后腦缺血再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞HSP70陽性表達(dá)的情況與腦缺血各組相似。
　　 結(jié)果表明，恩必普預(yù)處理能夠上調(diào)腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)，HSP70表達(dá)在1d達(dá)到高峰。
　　 3、HSP70抑制劑Quercetin能夠抑制恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用<

16、br>　　 硫堇染色結(jié)果顯示，sham組和恩必普預(yù)處理組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯的DND，HG為0～Ⅰ級(jí)，ND分別為200.2±5.1、201.3±5.4。腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的組織損傷，與sham組和恩必普預(yù)處理組比較，HG（Ⅱ-Ⅲ級(jí)）明顯升高，ND（44.3±8.3）顯著降低。恩必普預(yù)處理+腦缺血組中，海馬CA1區(qū)未見明顯細(xì)胞損傷，與腦缺血組相比，其HG（1級(jí)）明顯降低，ND（157±6.9）值明顯升高，表明恩必普預(yù)處理

17、可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受，減輕腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND。給予3％DMSO對恩必普誘導(dǎo)的腦缺血耐受無明顯影響，其HG和ND與恩必普預(yù)處理+腦缺血組相近。然而，給予HSP70合成抑制劑Quercetin則明顯阻斷了恩必普的腦保護(hù)作用，在海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了明顯的DND，與恩必普預(yù)處理+腦缺血組相比，其HG明顯升高（Ⅱ-Ⅲ級(jí)），ND值明顯降低（122.8±8.2）。
　　 結(jié)果表明，恩必普預(yù)處理后能夠誘導(dǎo)大鼠海馬CA1