膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織對(duì)HaCaT細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路表達(dá)的影響及意義.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織對(duì)HaCaT細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路表達(dá)的影響及意義姓名：唐浩程申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：張官萍20090509膽脂瘸囊內(nèi)碎屑組織對(duì)H a C a T 細(xì)胞P 3 8 M A P K 信r 弓．通路表達(dá)的影響及意義 中義摘要脂瘤病理機(jī)制中的作用的研究較少，本課題通過(guò)生物體外試驗(yàn)，用膽脂瘤囊內(nèi)容物萃取液干預(yù)H a C a Y 細(xì)胞，觀察H a C a T 細(xì)胞受干預(yù)后的增殖情況，

2、并檢測(cè)期間p 3 8 M A P K 信號(hào)通路的激活與表達(dá)情況，初步探討p 3 8 M A P K 信號(hào)途徑在膽脂瘤病理機(jī)制中的作用和意義。研究目的：用膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取液干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，以模擬簡(jiǎn)易膽脂瘤上皮細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，建立體外膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖模型，檢測(cè)是否存在p 3 8 M A P K 的激活與表達(dá)，探討p 3 8 M A P K 信號(hào)通路在中耳膽脂瘤病理機(jī)制中的作用。研究方法：H a C a T 細(xì)胞株培養(yǎng)傳

3、代：H a C a T 細(xì)胞( 人永生化表皮細(xì)胞，購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院廣州分院) ，傳代培養(yǎng)。膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取液的制備：術(shù)中收集膽脂瘤囊內(nèi)容物組織，急送一8 0 。C 冷存。試驗(yàn)時(shí)取出后，放置于勻漿器中，加少許液氮，快速研磨成粉狀，溶于無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液( p h o s p h a t eb u f f e r e d s o l u t i o nP B S ) 中，低溫1 2 0 0 0 轉(zhuǎn)／m i n 離心2 0m i n ，

4、留取上清，濾過(guò)除菌。進(jìn)行B r a d f o r d 法蛋白定量。試驗(yàn)一：膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取液對(duì)H a C a T 細(xì)胞增殖影響：對(duì)照組無(wú)菌P B S 干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組l 、2 、3 組分別按膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取原液、l ：1 0 稀釋原液、1 ：1 0 0 稀釋原液干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)4 8 小時(shí)以M T T 法檢測(cè)各組細(xì)胞數(shù)及活性。試驗(yàn)二：磷酸化p 3 8 M A P K 在H a C

5、a T 細(xì)胞表達(dá)的定性試驗(yàn)：對(duì)照組：無(wú)菌P B S干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取原液干預(yù)t l a C a T 細(xì)胞，用免疫組化的方法檢測(cè)干預(yù)后5 m i n 、t O m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 磷酸化p 3 8 M A P K在H a C a T 細(xì)胞的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三：p 3 8 M A P K 在H a C a T 細(xì)胞m R N A

6、 水平的表達(dá)定量分析：對(duì)照組無(wú)菌P B S干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組l 和實(shí)驗(yàn)組2 分別為：按膽脂瘤囊內(nèi)碎屑組織萃取原液、l ：2 稀釋原液干預(yù)H a C a T 細(xì)胞，干預(yù)后3 0 m i n 收集細(xì)胞提取m R N A ，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n —p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n R