BPA對大鼠睪丸支持細(xì)胞凋亡和JNK、P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、雙酚A(Bisphnol A,BPA)是一種環(huán)境雌激素，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，研究表明BPA具有類雌激素與抗雄激素的生物學(xué)作用。BPA作為生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等聚合物的重要原料被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，人類可經(jīng)過消化道、呼吸道和皮膚等途徑暴露于BPA。目前很多研究表明，BPA具有明顯的雄性生殖毒性作用，它可引起雄性嚙齒動物雄激素合成下降、精子生成減少、支持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，血睪屏障破壞等，進(jìn)而導(dǎo)致雄性動物生殖能力下降。本研究通過體外分離

2、培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞，觀察BPA對支持細(xì)胞的毒性作用，研究與細(xì)胞凋亡有關(guān)的JNK、P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過程中的調(diào)控作用。從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度研究BPA對支持細(xì)胞的毒性機(jī)制，這是本實驗的創(chuàng)新點。
　　第一部分：大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及BPA對支持細(xì)胞活力的影響
　　目的：①確定和完善大鼠睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，以獲得純度較高的支持細(xì)胞。探討B(tài)PA對體外培養(yǎng)支持細(xì)胞活力的影響，并確定BPA的作用劑量。
　

3、　方法：①在本實驗室前期支持細(xì)胞培養(yǎng)方法上加以改進(jìn)，采用兩酶三步消化法獲得純度較高的支持細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。②對離體培養(yǎng)的支持細(xì)胞分別用30、50、70和90μmol/L的BPA染毒24h后用MTT比色法測其在490nm波長下的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果：與溶劑對照組相比，50、70、90μmol/LBPA均使細(xì)胞吸光度值明顯下降（P<0.05）；細(xì)胞存活率隨染毒劑量的增加而逐漸下降，70μmol/LBPA劑量組的

4、細(xì)胞存活率為75.81％，因此以此劑量為最高劑量，確定BPA染毒濃度分別為0、30、50、70μmol/L。
　　結(jié)論：①本研究中的支持細(xì)胞培養(yǎng)方法可以獲得純度較高、生長狀態(tài)良好的睪丸支持細(xì)胞。?BPA可使體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞活力下降，對支持細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性作用。③明確了后續(xù)研究的最高染毒濃度為70μmol/LBPA。
　　第二部分：BPA對支持細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因和蛋白的影響
　　目的：觀察BPA染毒支持細(xì)胞24h后

5、，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因fasL、TNF-α和caspase3 mRNA及caspase3酶原蛋白在支持細(xì)胞中的表達(dá)變化，以研究BPA對支持細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　方法：用Real time-PCR(RT-PCR)法檢測支持細(xì)胞內(nèi)fasL、TNF-α和caspase3 mRNA的相對表達(dá)情況；用Western blotting法檢測Procaspase3蛋白的表達(dá)情況，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及Procaspase3在細(xì)胞

6、中的定位和定性表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與溶劑對照組相比，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因fasL mRNA的表達(dá)量在50、70μmol/LBPA劑量組明顯增加（p＜0.05）、TNF-α在50μmol/LBPA劑量組明顯增加；各劑量的BPA均使caspase3 mRNA相對表達(dá)量明顯上升（p＜0.05）。70μmol/LBPA劑量組Procaspase的表達(dá)量與溶劑對照相相比顯著降低（p＜0.05），免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示，70μmol/LBPA使

7、支持細(xì)胞輪廓不清，細(xì)胞間界限不明顯，細(xì)胞形態(tài)被破壞；Procaspase3位于細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)量有隨著染毒劑量的增加而逐漸減少的趨勢。
　　結(jié)論：FasL與Fas結(jié)合后，募集細(xì)胞內(nèi)死亡信號分子組成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（Death inducing signaling complex，DISC），通過caspase途徑最終激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase3,該蛋白的激活意味著細(xì)胞凋亡的不可逆轉(zhuǎn)性，BPA可導(dǎo)致FasL的表達(dá)增加，激活ca

8、spase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，支持細(xì)胞數(shù)量的減少可能是BPA所引起生殖毒性的一個重要機(jī)制。
　　第三部分：BPA對支持細(xì)胞中JNK和P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　目的：探討B(tài)PA染毒支持細(xì)胞24h后，JNK和P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)變化
　　方法：BPA染毒離體培養(yǎng)的支持細(xì)胞24h后，①用RT-PCR法檢測細(xì)胞中JNK信號通路關(guān)鍵基因ASK1、MKK7、JNK1、c-jun和 P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因

9、p38、CHOP、CREB mRNA的相對表達(dá)情況；②用Western blotting方法檢測細(xì)胞中JNK、磷酸化JNK(Phosphorylated JNK,P-JNK)、P38、磷酸化P38(Phosphorylated P38,P-P38)的蛋白相對表達(dá)量。
　　結(jié)果：①與溶劑對照組相比，ASK1 mRNA的相對表達(dá)量在70μmol/LBPA劑量組顯著增加（p＜0.05）；MKK7 mRNA的相對表達(dá)量在各劑量組均有明顯下

10、降（p＜0.05）；JNK1的表達(dá)量無明顯變化；c-jun mRNA的相對表達(dá)量隨染毒劑量的增加而逐漸增加，50、70μmol/LBPA劑量組表達(dá)量與溶劑對照組的差異具有顯著性意義（p＜0.05）。與溶劑對照組相比，30μmol/LBPA可使p38 mRNA的表達(dá)量明顯增加（p＜0.05），而50μmol/LBPA使p38的表達(dá)量明顯降低（p＜0.05），70μmol/LBPA無明顯變化；CHOP和CREB的表達(dá)量在BPA各劑量組均顯著

11、增加（p＜0.05）;②與溶劑對照組相比，JNK蛋白相對表達(dá)量各劑量組無明顯變化，70μmol/LBPA可使P-JNK的相對表達(dá)量明顯增高（p＜0.05）；P38的表達(dá)量在各劑量組也無明顯差異，P-P38在50、70μmol/LBPA劑量組的相對表達(dá)量與溶劑對照組的差異具有顯著性意義（p＜0.05）。
　　結(jié)論：BPA作用下，支持細(xì)胞中JNK和P38被激活，ASK1 mRNA的表達(dá)量也明顯增高，信號通路下游基因c-jun、CHOP