小鼠視網(wǎng)膜On--Off-通路中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能特性及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 視網(wǎng)膜接收視覺(jué)信號(hào),并將其中所包含的視覺(jué)信息編碼成不同序列的神經(jīng)沖動(dòng)傳向大腦。不同的信號(hào)傳遞通路參與處理不同的視覺(jué)信息。視錐通路參與編碼光強(qiáng)度相對(duì)較高的明視覺(jué)信息,視桿通路參與編碼光強(qiáng)度相對(duì)較低的暗視覺(jué)信息。在不同強(qiáng)度光適應(yīng)條件下,光的增強(qiáng)和減弱信號(hào)分別通過(guò)不同的視錐、視桿信號(hào)傳遞通路進(jìn)行處理。傳遞光增強(qiáng)信號(hào)的通路稱為On-通路,傳遞光減弱信號(hào)的通路稱為Off-通路。
　　 在暗視覺(jué)條件下,光的增強(qiáng)信號(hào)是由

2、兩條DL-2-氨基-4-磷丁酸(DL-2-amino-4-phosphonobutyric acid,APB)敏感的視覺(jué)通路進(jìn)行傳遞的:①視桿細(xì)胞→視桿雙極細(xì)胞→AⅡ型無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞→緊密連接→On視錐雙極細(xì)胞→On神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。②視桿細(xì)胞→緊密連接→視錐細(xì)胞→On視錐雙極細(xì)胞→On神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。APB可阻斷這兩條通路的信號(hào)傳導(dǎo)。光的減弱信號(hào)是由三條不同的APB敏感和不敏感的視桿Off-通路進(jìn)行處理的:①視桿細(xì)胞→視桿雙極細(xì)胞→AⅡ型無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞

3、→甘氨酸能突觸→Off視錐雙極細(xì)胞→Off神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。②視桿細(xì)胞→緊密連接→視錐細(xì)胞→Off視錐雙極細(xì)胞→Off神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。③視桿細(xì)胞→直接與Off視錐雙極細(xì)胞相聯(lián)系→Off神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。①為APB敏感的視桿Off-通路,②和③為APB不敏感的視桿Off-通路。在明視覺(jué)條件下,處理光增強(qiáng)信號(hào)的通路為:視錐細(xì)胞→On視錐雙極細(xì)胞→On神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；處理光減弱信號(hào)的通路為:視錐細(xì)胞→Off視錐雙極細(xì)胞→Off神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
　　 研究發(fā)現(xiàn)

4、,暗視覺(jué)條件下,APB敏感的視桿Off-通路的光反應(yīng)閾值低于APB不敏感的視桿Off-通路；對(duì)人類視網(wǎng)膜的研究發(fā)現(xiàn),存在傳遞慢的、低強(qiáng)度光信號(hào)和傳遞快的、高強(qiáng)度光信號(hào)的兩條視桿通路；一氧化氮(nitric oxide,NO)可選擇性地阻斷雪貂視網(wǎng)膜APB敏感的視桿Off-通路的Off光反應(yīng)；暗視覺(jué)條件下,神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)缺乏可降低視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retina

5、l ganglion cell,RGC)的光敏性。由此可見(jiàn),不同的On-/Off-通路分別具有不同的功能特性和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 眾所周知,視網(wǎng)膜中,各視覺(jué)通路最終都會(huì)聚在各自的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上,故神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)反映了視網(wǎng)膜中視覺(jué)信號(hào)處理的最終結(jié)果。因此,為了進(jìn)一步明確這些視覺(jué)通路不同的光反應(yīng)特性、光刺激.反應(yīng)關(guān)系、NO對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞光敏性的影響及不同通路功能特性的調(diào)節(jié)機(jī)制,本研究采用全細(xì)胞電流鉗及電壓鉗技術(shù)對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行了記錄。<

6、br>　　 方法：
　　 1、C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜鋪片。
　　 2、通過(guò)帶有綠色(P-43,545nm光線)磷光體的陰極射線管發(fā)出方波光斑刺激,照射視網(wǎng)膜以誘發(fā)RGC光反應(yīng)。
　　 3、暗視覺(jué)條件下,電流鉗記錄APB敏感和不敏感的視桿Off-通路中RGC的光反應(yīng),并對(duì)反應(yīng)的最高放電頻率和潛伏時(shí)進(jìn)行測(cè)定。
　　 4、暗、明視覺(jué)條件下,電流鉗記錄不同On-和Off-通路中RGC對(duì)不同頻率閃光刺激的光反應(yīng)

7、,分析其對(duì)閃光刺激的頻率跟隨能力。
　　 5、暗視覺(jué)條件下,應(yīng)用NO供體,S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpeni-cillamine,SNAP),觀察其對(duì)APB敏感和不敏感的視桿Off-通路中RGC光反應(yīng)的影響。
　　 6、明視覺(jué)條件下,記錄RGC的自發(fā)和光誘發(fā)的興奮性和抑制性突觸后電壓和電流,觀察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的抑制劑,nω-硝基-L

8、-精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)對(duì)RGC光敏性的影響并探討其機(jī)制。
　　 7、應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡,對(duì)標(biāo)記的RGC進(jìn)行分層掃描,拍照并進(jìn)行三維重建以判斷RGC的分型。
　　 結(jié)果：
　　 1、暗視覺(jué)條件下,APB敏感的視桿Off-通路中RGC的Off光反應(yīng)的潛伏時(shí)顯著長(zhǎng)于APB不敏感視桿Off-通路,而兩條通路中RGC的Off光反應(yīng)的最高放電頻率無(wú)顯著

9、差異。
　　 2、暗視覺(jué)條件下,APB敏感視桿Off-通路中RGC的Off光反應(yīng)所能跟隨的最高閃光刺激頻率顯著低于APB不敏感視桿off-通路。視桿On-通路的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所能跟隨的最高閃光刺激頻率顯著高于APB敏感的視桿Off-通路。由暗視覺(jué)轉(zhuǎn)到明視覺(jué)條件下,APB敏感和不敏感的視桿off-通路中RGC的Off光反應(yīng)所能跟隨的閃光刺激頻率均顯著升高。
　　 3、暗視覺(jué)條件下,NO選擇性地阻斷小鼠視網(wǎng)膜上APB敏感的視桿O

10、ff-通路的光反應(yīng)。
　　 4、明視覺(jué)條件下,L-NAME降低On-/Off-通路中RGC的光敏性。
　　 5、明視覺(jué)條件下,L-NAME降低了On-/Off-通路中RGC的自發(fā)和光誘發(fā)的抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current,IPSC)的幅度。應(yīng)用士的寧(strychinine,STR)和印防己毒素(picrotoxin,PTX)消除抑制性突觸輸入后,L-NAME可顯著降低RG

11、C的自發(fā)和光誘發(fā)的興奮性突觸后電流(excitatorypostsynaptic current,EPSC)的幅度,減少自發(fā)性EPSC(spontaneous EPSC,sEPSC)的發(fā)生頻率。
　　 6、在明視覺(jué)條件下,應(yīng)用羥基胺(hydroxylamine,HA)漂白視錐細(xì)胞后,L-NAME對(duì)RGC的sEPSC的幅度和發(fā)生頻率無(wú)顯著影響。在應(yīng)用APB減少谷氨酸釋放到RGC后,L-NAME對(duì)RGC的sEPSC的幅度和發(fā)生頻率無(wú)

12、顯著影響。
　　 討論
　　 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠視網(wǎng)膜上不同的On-/Off-通路確實(shí)存在不同的功能特性和調(diào)節(jié)機(jī)制。暗視覺(jué)條件下,APB敏感視桿Off-通路中RGC的Off光反應(yīng)的潛伏時(shí)顯著長(zhǎng)于APB不敏感視桿Off-通路。可能的因?yàn)橛卸?①APB敏感和不敏感的視桿Off-通路的視網(wǎng)膜環(huán)路不同,APB敏感比不敏感的視桿Off-通路中的突觸數(shù)目多。②APB敏感的視桿Off-通路信號(hào)傳遞效率較低。另外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)APB

13、不敏感的視桿Off-通路中RGC的光反應(yīng)能穩(wěn)定跟隨較高頻率的閃光刺激。也有研究發(fā)現(xiàn),APB敏感的視桿Off-通路光刺激閾值低于APB不敏感的視桿Off-通路。因此,我們認(rèn)為,APB敏感的視桿Off-通路處理低頻率、低強(qiáng)度的光減弱信號(hào),并向大腦傳遞信號(hào)的速度較慢；而APB不敏感的視桿Off-通路介導(dǎo)頻率和強(qiáng)度相對(duì)較高的光減弱信號(hào),且將信號(hào)傳向大腦速度較快。以往研究顯示,NO可選擇性地阻斷雪貂視網(wǎng)膜APB敏感的視桿Off-通路的Off反應(yīng)。

14、我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠的視網(wǎng)膜上也存在這一現(xiàn)象。這一結(jié)果表明,APB敏感和不敏感的視桿Off-通路不僅分別傳遞不同的視覺(jué)信息,而且也存在著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。從小鼠和雪貂視網(wǎng)膜的研究結(jié)果來(lái)看,NO對(duì)APB敏感視桿off-通路的特異性調(diào)節(jié)可能是適用于不同種系動(dòng)物的一個(gè)普遍現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 1、APB敏感的視桿Off-通路處理低頻率、低強(qiáng)度的光減弱信號(hào),并向大腦傳遞信號(hào)的速度較慢；而APB不敏感的視桿Off-通路介導(dǎo)頻率

15、和強(qiáng)度相對(duì)較高的光減弱信號(hào),且將信號(hào)傳向大腦速度較快。
　　 2、NO選擇性調(diào)節(jié)小鼠視網(wǎng)膜APB敏感的視桿off-通路。
　　 3、位于AⅡ型無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞與Off視錐雙極細(xì)胞之間的甘氨酸能突觸很可能限控了APB敏感的視桿Off-通路的頻率跟隨特性。
　　 4、視桿細(xì)胞限制了APB不敏感的視桿Off-通路的閃光刺激頻率跟隨特性。
　　 5、明適應(yīng)條件下,L-NAME可能通過(guò)抑制視錐細(xì)胞中NOS的活性,降低NO