糖尿病引起的小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)的變化.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由高血糖癥(hyperglycemia)造成的常見疾病，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家均呈升高趨勢(shì)。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)，或稱糖網(wǎng)病，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，可引起視覺功能的減退，甚至導(dǎo)致失明。DR不僅損傷視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)，還可破壞視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)。雖然已有大量研究報(bào)道糖尿病患者和糖尿病模型動(dòng)物的視網(wǎng)膜神經(jīng)元受損及發(fā)生退行性的病變，然而

2、，對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能在糖尿病狀態(tài)下所產(chǎn)生的變化及其生理機(jī)制，目前仍不清楚。這是對(duì)DR的治療和預(yù)防尚缺乏有效手段的重要原因之一。
　　視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（ganglion cell，GC）是視網(wǎng)膜中的第三級(jí)神經(jīng)元，也是視網(wǎng)膜唯一的輸出神經(jīng)元。它們接收并整合來(lái)自各種上級(jí)神經(jīng)元的視覺信號(hào)，包括雙極細(xì)胞的興奮性輸入，以及無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的抑制性輸入;對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行初步加工后，以動(dòng)作電位的形式向高級(jí)視覺中樞傳遞。所以，GC在視網(wǎng)膜信號(hào)處理過程中

3、扮演重要角色，其功能異常往往導(dǎo)致嚴(yán)重的視覺疾病。GC位于視網(wǎng)膜表面，易于觀察、記錄，近年來(lái)對(duì)其研究不斷取得進(jìn)展，但在單細(xì)胞層次研究糖尿病影響GC功能的工作非常罕見。在本研究中，我們通過在單細(xì)胞水平，大樣本分析糖尿病動(dòng)物GC的電生理活動(dòng)，探索視網(wǎng)膜神經(jīng)環(huán)路在糖尿病狀態(tài)下的變化。
　　在本工作中，我們采用STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型糖尿病的C57小鼠作為動(dòng)物模型，在糖尿病發(fā)病3～4個(gè)月時(shí)，觀察了暗適應(yīng)狀態(tài)下視網(wǎng)膜鋪片標(biāo)本中GC的生理活動(dòng)，包括G

4、C的對(duì)光反應(yīng)和自發(fā)放電活動(dòng);并使用細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)技術(shù)，觀察了視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的情況。
　　小鼠經(jīng)腹腔注射STZ后，血糖值顯著上升并保持在高水平，且體重的變化以及多飲多尿的特點(diǎn)均符合Ⅰ型糖尿病的特征，表明我們所建立的動(dòng)物疾病模型有效、可靠。在成功誘導(dǎo)高血糖癥3～4個(gè)月后，我們采用非緊密封接的細(xì)胞貼附式膜片鉗記錄(即loose-patch)法，在暗適應(yīng)后的小鼠視網(wǎng)膜鋪片標(biāo)本上，對(duì)GC進(jìn)行記錄。
　　在接受光刺激后，正常視網(wǎng)膜中的

5、絕大多數(shù)GC可產(chǎn)生ON型和/或OFF型光反應(yīng)，根據(jù)以上反應(yīng)極性，可將GC分為ON-GC、OFF-GC和ON-OFF-GC這三種基本的生理學(xué)亞型。我們觀察到，在糖尿病情況下，有相當(dāng)一部分GC失去了對(duì)光反應(yīng)能力。這一現(xiàn)象初步提示，糖尿病影響了GC的基本生理反應(yīng)，這可能導(dǎo)致視覺功能的損傷。
　　本工作的主要研究對(duì)象，是小鼠視網(wǎng)膜GC在暗中的自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放（即自發(fā)放電）情況。我們對(duì)各亞型GC的自發(fā)放電活動(dòng)進(jìn)行連續(xù)的loose-patch

6、記錄，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，取時(shí)長(zhǎng)為1分鐘的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。我們觀察到，GC的自發(fā)放電頻率在不同神經(jīng)元之間差異很大;對(duì)三個(gè)亞類的GC分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)ON-和OFF-GC的自發(fā)放電頻率分布均呈現(xiàn)非正態(tài)分布的特征。STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病3個(gè)月后，ON-GC的自發(fā)放電頻率顯著高于對(duì)照組，且成簇發(fā)放(burst)增多，表現(xiàn)為成簇發(fā)放的頻率，及其所占時(shí)間在細(xì)胞總的活動(dòng)時(shí)間中的比例均顯著增高。我們所記錄到的OFF-和ON-OFF-GC的數(shù)目遠(yuǎn)比ON-

7、GC要少，在現(xiàn)有的樣本量基礎(chǔ)上進(jìn)行的分析顯示，它們的自發(fā)放電頻率在糖尿病組和對(duì)照組間均沒有差異。
　　我們進(jìn)而使用藥理學(xué)手段，進(jìn)一步探討糖尿病動(dòng)物ON-GC自發(fā)放電增強(qiáng)的可能機(jī)制。在暗中，當(dāng)使用突觸阻斷劑混合物阻斷視網(wǎng)膜內(nèi)主要的化學(xué)突觸傳遞后，正常小鼠視網(wǎng)膜ON-GC的自發(fā)放電活動(dòng)能夠被完全壓抑，表明這種活動(dòng)是完全依賴于突觸輸入的。在糖尿病中，大部分ON-GC保持這種生理特性，而有一部分的ON-GC出現(xiàn)了突觸輸入非依賴的自發(fā)放電活

8、動(dòng)。提示糖尿病可能改變了一部分ON-GC的內(nèi)源性電生理特性。
　　GABA受體和甘氨酸受體介導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)主要的抑制性信號(hào)傳遞。在Ringer's液中施加以上兩種受體的拮抗劑，阻斷對(duì)ON-GC的抑制性輸入后，糖尿病組和對(duì)照組ON-GC的自發(fā)放電頻率均出現(xiàn)升高，且升高后的放電頻率在兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。該結(jié)果與正常Ringer's液中糖尿病組ON-GC的自發(fā)放電頻率顯著高于對(duì)照組的現(xiàn)象相結(jié)合，提示在糖尿病狀態(tài)下，上級(jí)神經(jīng)元對(duì)ON-

9、GC的抑制性輸入是減弱的，這可能是造成ON-GC自發(fā)活動(dòng)增多的主要機(jī)制之一;另一方面，該結(jié)果也提示，暗適應(yīng)中的ON-GC所接受的興奮性輸入，在糖尿病狀態(tài)下并未發(fā)生改變。
　　我們對(duì)小鼠全視網(wǎng)膜鋪片進(jìn)行TUNEL標(biāo)記，并使用DAPI復(fù)染來(lái)確認(rèn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的位置，以排除TUNEL檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性信號(hào)的干擾。使用Neurolucida系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)TUNEL信號(hào)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病3個(gè)月時(shí)，單位面積視網(wǎng)膜中的TUNEL陽(yáng)性信號(hào)總數(shù)沒有

10、顯著變化。此結(jié)果提示，在我們的動(dòng)物模型所處的糖尿病早期階段，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡水平尚未受到明顯影響。
　　綜上所述，我們得到的結(jié)論是:在STZ誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)病3個(gè)月時(shí)，雖然小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元未發(fā)生大規(guī)模的凋亡，然而此時(shí)GC的生理功能已經(jīng)受到了顯著的影響，這些影響包括:GC對(duì)光反應(yīng)能力的丟失、ON-GC自發(fā)活動(dòng)水平的增高、內(nèi)源性電生理特性可能發(fā)生的改變以及其所接受的抑制性突觸輸入的減弱等。這些發(fā)現(xiàn)將為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)早期糖尿病時(shí)，視網(wǎng)膜