基于二維液相色譜技術的元胡活性成分篩選及其藥效和毒性機制的蛋白組學研究.pdf

1、“中藥研究中最困難的，也是最重要的一點，就是找出它的有效成分，然后進行作用機制研究，并將其推薦于臨床應用，或進一步進行構效關系研究，以求新的發(fā)展。”（陳宜張于《中藥延胡索研究中的新發(fā)現》序三）。盡管中藥的應用歷史可以追溯幾千年，但是中藥發(fā)揮療效的物質基礎是什么?其作用的靶點是什么?作用機制是什么?這些問題一直未被世人所徹底揭示。近年來，隨著中藥不良反應的增加，許多傳統(tǒng)認為沒有毒性的中藥也出現不良反應，對中藥不良反應的認識，不能再局限于傳

2、統(tǒng)文獻記載的那些有毒中藥上，必須利用現代科技開展藥物安全性評價工作并對中藥的毒理機制進行系統(tǒng)研究。另外，如何在中醫(yī)藥基本理論的指導下，結合現代科研手段，在細胞和分子水平明確中藥的作用靶點和分子機制，也是目前中藥研究亟需解決的問題。
　　 系統(tǒng)生物學是研究一個生物系統(tǒng)中所有組成成分（基因、mRNA、蛋白質、代謝物等）的構成，以及在特定條件下這些組分間相互關系的學科。系統(tǒng)生物學的研究方法與中醫(yī)治療疾病的整體觀念是一致的。蛋白組學是系

3、統(tǒng)生物學的重要組成部分。蛋白組學認為中藥有效部位或有效成分進入細胞或組織發(fā)揮作用，必然會引起分子、細胞、器官、整體多個層面的結構與功能狀態(tài)的改變。蛋白質是生物體內功能的執(zhí)行者，生物體結構和功能狀態(tài)的改變必然在蛋白組水平上表現出來。因此，蛋白組學以蛋白質的豐度或翻譯后修飾為指標，對中藥活性成分的作用靶點和效應蛋白進行識別，建立起相應的作用網絡，探討其藥理、毒副作用機制。化學蛋白組學主要用于研究在復雜蛋白質體系中，能與活性小分子相互作用的蛋

4、白組。通過對該活性小分子進行標記或固定化，可以實現與其相互作用的蛋白組的選擇性富集和鑒定。與傳統(tǒng)的差異蛋白組學技術相比，只有與被標記或固定化小分子相互作用的蛋白質才能夠被富集并檢測，因而可以大大降低特定蛋白組的復雜度，從而提高對中、低豐度蛋白的檢測能力。此外，通過質譜鑒定可以獲得關于活性小分子靶蛋白的信息，并進一步闡述該分子的可能作用機理。
　　 本課題以傳統(tǒng)中藥元胡為研究對象，以二維液相色譜-串聯(lián)質譜為檢測手段，借助血清藥理學

5、的研究理念，篩選中藥元胡的活性鎮(zhèn)痛成分；基于二維液相的篩選結果及相關文獻報道，我們發(fā)現左旋延胡索乙素（l-THP）是元胡的主要鎮(zhèn)痛活性成分之一，并對其進行進一步研究。首先，我們應用液相色譜-串聯(lián)質譜法結合微透析取樣方法研究l-THP在大鼠紋狀體的藥代動力學；針對l-THP臨床應用中出現的肝臟毒副作用，本文應用2D-nano-LC-MS/MS技術，研究其肝臟毒性的分子機制；l-THP能明顯抑制福爾馬林誘導的疼痛行為，本文聯(lián)用差異蛋白組學和

6、化學蛋白組學技術，研究l-THP的作用靶點和鎮(zhèn)痛機制，具體內容包括：
　　 1.本文首先建立了福爾馬林鎮(zhèn)痛模型以評價元胡總生物堿（TAC）的鎮(zhèn)痛效果，發(fā)現灌胃給藥元胡總生物堿150 mg/kg后能夠有效抑制福爾馬林誘導的疼痛行為。接下來我們利用HSA生物色譜柱和ODS整體柱建立全二維液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng)，通過比對元胡總生物堿、元胡總生物堿入血和入紋狀體成分之間的差異，初步篩選元胡生物堿的鎮(zhèn)痛活性成分。在系統(tǒng)優(yōu)化全二維液相色譜串

7、聯(lián)質譜法條件后，我們將其應用于TAC的原成分、入血成分及入紋狀體成分的分析。在原成分分析時，我們共檢測到100多個化學成分，并對其中13種成分進行結構鑒定；們共檢測到40余種入血成分并鑒定了其中7種主要成分，分別是原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿、小檗堿、四氫小檗堿和藍堇辛；在進入紋狀體的約20種化合物中，4種原形化合物（原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿）的濃度較高。通過文獻查閱，我們發(fā)現這4種化學物具有潛在的鎮(zhèn)痛作用。盡管

8、對元胡總生物堿的鎮(zhèn)痛機制研究還存在很多不確定的因素，需要進一步探討和驗證，但是我們推測TAC的鎮(zhèn)痛作用與原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿的協(xié)同作用有關。本文的研究結果顯示全二維液相色譜串聯(lián)質譜技術是中藥活性成分篩選的有效工具，能為中藥的作用機制研究提供有效的信息。
　　 2.L-THP是元胡的主要活性成分之一，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，作為鎮(zhèn)痛藥在臨床上已應用多年。L-THP是多巴胺受體的阻滯劑，通過阻滯紋狀體的D2多巴胺受體，

9、抑制痛覺信息在脊髓水平的傳遞，實現鎮(zhèn)痛作用。本研究首先建立了大鼠腦部紋狀體的微透析取樣模型，通過反透析法測定l-THP在紋狀體內的回收率，并考察了l-THP濃度、取樣時間對體內回收率的影響，發(fā)現微透析采樣技術能夠用于l-THP在腦部紋狀體組織的藥代動力學研究。另外，我們建立了高通量、高靈敏度的LC-MS/MS分析方法，并進行了完整的方法學驗證。本文的研究證實微透析技術結合LC-MS/MS分析方法，能夠成功的用于l-THP在紋狀體的藥代動

10、力學研究。
　　 3.L-THP是臨床上應用多年的鎮(zhèn)痛藥，但是近年來，l-THP在臨床應用中出現了嚴重的肝臟副作用。在本文中，我們發(fā)現l-THP能夠誘導BALB/c小鼠肝細胞和human liver L-02細胞凋亡。通過Western Blots實驗，我們證實一些凋亡指標性蛋白（easpase-3、Bcl-2、Bax）的表達發(fā)生了顯著變化。我們以human liver L-02（L-02）細胞為研究對象，應用基于2D-nano

11、-LC-MS/MS的高通量蛋白組學研究技術，研究L-02細胞在毒性劑量的l-THP處理后，在蛋白表達層次上呈現的差異，從而探索l-THP致肝損傷可能的信號途徑。我們發(fā)現經過l-THP處理后，L-02細胞共有156個蛋白的表達呈現明顯差異。這些蛋白涵蓋了復雜的功能領域，包括能量代謝、細胞骨架、核酸代謝和細胞凋亡等。我們選取了跟凋亡相關的蛋白進行功能探討，并且選取兩個重要蛋白（mTOR and MEK2），對其含量表達進行Western B

12、lots驗證。最后我們發(fā)現，l-THP主要通過改變凋亡途徑中發(fā)揮重要作用的一些蛋白的表達，誘導細胞凋亡。并且從本實驗可以看出，基于納升級二維液相色譜-串聯(lián)質譜技術的蛋白組學是研究藥源性肝毒性機制的有效手段。
　　 4.L-THP能明顯抑制福爾馬林誘導的疼痛行為，本文聯(lián)用差異蛋白組學和化學蛋白組學技術，研究l-THP的作用靶點和鎮(zhèn)痛機制。口服40 mg/kg的l-THP能夠顯著抑制福爾馬林產生的疼痛行為?；谖墨I報道，紋狀體是l-

13、THP的主要鎮(zhèn)痛部位。我們以紋狀體蛋白組為研究對象，應用基于2D-nano-LC-MS/MS的高通量蛋白組學研究技術，研究福爾馬林致痛大鼠在l-THP處理后，其紋狀體蛋白組的表達差異。我們設定了嚴格的標準，對鑒定到的上千種蛋白進行篩選。最終我們選取得到17種具有顯著表達差異的蛋白。我們通過對隨機抽取的兩種蛋白（Neurabin-1和Calcium-dependent secretion activator1）的含量進行WesternBl

14、ots驗證，驗證蛋白組學結果的可靠性，發(fā)現Western Blots實驗結果能與蛋白組學結果較好吻合。另外，我們合成了基于l-THP的分子探針，通過化學蛋白組學技術，研究能與l-THP相互作用的蛋白組。我們發(fā)現差異蛋白組學和化學蛋白組學的結果能夠較好互補的。綜合化學蛋白組學和差異蛋白組學的研究結果，我們發(fā)現與離子通道，神經遞質釋放以及信號傳導途徑等相關蛋白在l-THP的鎮(zhèn)痛機制中發(fā)揮重要作用。并且，聯(lián)用差異蛋白組學和化學蛋白組學技術能夠