缺血預(yù)處理和藥物預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響及其與Rho激酶的關(guān)系.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克病人常出現(xiàn)不同程度的血管低反應(yīng)性，即全身血管對(duì)于外源性及內(nèi)源性的血管舒縮物質(zhì)反應(yīng)降低或者不反應(yīng)。這種血管低反應(yīng)性的發(fā)生嚴(yán)重影響著休克的發(fā)生、發(fā)展以及治療，是休克后期血壓難以回升和導(dǎo)致死亡的重要原因之一因此尋找休克低血管反應(yīng)性的保護(hù)措施非常重要。近年來(lái)缺血預(yù)處理(ischemic preconditionging，IPC)作為一種有效的內(nèi)源性保護(hù)方法已被證實(shí)對(duì)心臟、腦、腎臟、肝臟、肺臟、胃、腸和骨骼肌等器官缺血再灌注損傷具有

2、保護(hù)作用，具有一定的器官普遍性。近來(lái)有學(xué)者提出大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)參與了IPC的心肌保護(hù)作用，BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理可模擬缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。缺血預(yù)處理和BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理是否可對(duì)失血性休克所致的血管低反應(yīng)性發(fā)揮保護(hù)作用？其機(jī)制如何？目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明休克后VSMC肌肉收縮蛋白可能存在鈣失敏，鈣失敏在休克后血管低反應(yīng)性的形成中起重要的作用，而Rho激酶在失血性休克后大鼠血管鈣敏

3、感性變化中起重要調(diào)節(jié)作用。Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ可明顯升高休克血管環(huán)對(duì)Ca2+的敏感性和對(duì)NE的收縮反應(yīng)性，提示Rho激酶有可能成為恢復(fù)休克血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。為探討缺血預(yù)處理和BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理是否可通過(guò)激活Rho激酶改善休克后低血管反應(yīng)性及其機(jī)制，本研究擬以失血性休克大鼠為模型研究了缺血預(yù)處理和BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理對(duì)失血性休克后低反應(yīng)血管的影響及與Rho激酶的關(guān)系，具體內(nèi)容包括兩部分，分為：(

4、1)缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響及與Rho激酶的關(guān)系；(2)BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響與Rho激酶的關(guān)系。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分，觀察缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響及與Rho激酶的關(guān)系。包括：觀察采用不同缺血預(yù)處理方法(夾閉腹主動(dòng)脈1min，開(kāi)放5min；夾閉3min，開(kāi)放3min；夾閉3min，開(kāi)放5min，

5、均重復(fù)3次，2h后復(fù)制失血性休克模型)后失血性休克大鼠24h存活率和存活時(shí)間的變化。從整體動(dòng)物水平觀察缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠NE升壓效應(yīng)及在體腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE收縮反應(yīng)性的影響，分別在休克前，休克后10min，30min，1h，2h，3h和4h經(jīng)股靜脈給予NE(3μg/kg),記錄大鼠使用NE前后股動(dòng)脈壓的變化情況；同時(shí)采用倒置顯微鏡觀察使用NE前后在體腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)管徑

6、的變化。從離體水平，觀察缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響，取失血性休克大鼠SMA，利用離體血管環(huán)測(cè)定技術(shù)，觀察缺血預(yù)處理后休克不同時(shí)相點(diǎn)(休克10min，休克30min，休克1h，休克2h，休克3h)SMA血管反應(yīng)性(血管環(huán)對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的收縮反應(yīng)性)和鈣敏感性(血管環(huán)在120mmol/L K+去極化狀態(tài)下，對(duì)梯度濃度Ca2+的反應(yīng)性)的變化。取SMA，分別采用weste

7、rn blotting和pulldown的方法測(cè)定SMA肌球蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)亞單位(MYPT)磷酸化水平和RhoA活性的變化以觀察缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克后期(休克3h)大鼠SMA Rho激酶和RhoA活性的影響。應(yīng)用離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀察Rho激酶活性抑制劑Y-27632和RhoA活性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶對(duì)缺血預(yù)處理后失血性休克后期(休克3h)SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響，同時(shí)觀察RhoA活性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶對(duì)缺血預(yù)處理后失血性休克后期(休

8、克3h)Rho激酶活性的影響。初步探討缺血預(yù)處理引起失血性休克后期Rho激酶活性變化的機(jī)制，應(yīng)用RhoGEF活性測(cè)定試劑盒測(cè)定失血性休克后期(休克3h)SMA p115-RhoGEF，PDZ-RhoGEF和LARG活性變化及缺血預(yù)處理對(duì)其的作用。
　　第二部分，觀察BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響及與Rho激酶的關(guān)系。包括：觀察應(yīng)用NS1619不同劑量預(yù)處理(腹腔注射NS16190.5

9、×10-3μg/Kg，1×10-3μg/Kg，2×10-3μg/Kg，4×10-3μg/Kg體重，30min后復(fù)制失血性休克模型)后失血性休克大鼠72h存活時(shí)間和存活率的變化。從離體水平，觀察缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響，取失血性休克大鼠SMA，利用離體血管環(huán)測(cè)定技術(shù)，觀察缺血預(yù)處理后休克不同時(shí)相點(diǎn)(休克10min，休克30min，休克1h，休克2h，休克3h)SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的變化。取SMA，分別采用

10、western blotting和G-LISA的方法測(cè)定SMA肌球蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)亞單位(MYPT)磷酸化水平和RhoA活性的變化以觀察NS1619預(yù)處理對(duì)失血性休克后期(休克3h)大鼠SMA Rho激酶和RhoA活性的影響。應(yīng)用離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀察Rho激酶活性抑制劑Y-27632和RhoA活性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶對(duì)NS1619預(yù)處理后失血性休克后期(休克3h)SMA血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響，同時(shí)觀察RhoA活性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶對(duì)NS16

11、19預(yù)處理后失血性休克后期(休克3h)Rho激酶活性的影響。初步探討NS1619預(yù)處理引起失血性休克后期Rho激酶活性變化的機(jī)制，應(yīng)用RhoGEF活性測(cè)定試劑盒觀察失血性休克后期(休克3h)SMA p115-RhoGEF，PDZ-RhoGEF和LARG活性變化及NS1619預(yù)處理對(duì)其的作用。
　　主要研究結(jié)果：
　　1.缺血預(yù)處理(夾閉腹主動(dòng)脈1min，開(kāi)放5min，重復(fù)3次)和BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理(腹腔注射

12、NS16192×10-3μg/Kg)可明顯增加失血性休克大鼠存活率和存活時(shí)間(P＜0.05)。
　　2.失血性休克早期(休克10min)大鼠對(duì)NE的升壓反應(yīng)增加，在體腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)亦明顯增高(P＜0.01)；失血性休克后期(休克3h)大鼠對(duì)NE的升壓反應(yīng)和在體腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)明顯降低(P＜0.01)。缺血預(yù)處理可明顯增加失血性休克大鼠對(duì)NE的升壓反應(yīng)和在體腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)(P＜0.01)。

13、r>　　3.休克早期(休克10min)，離體SMA血管環(huán)對(duì)NE的收縮反應(yīng)性明顯升高，量-效累積曲線明顯左移，最大收縮力(maximal contraction，Emax)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)，血管環(huán)對(duì)NE的收縮反應(yīng)性和鈣敏感性逐漸下降，在休克后期(休克2h和休克3h)，血管環(huán)對(duì)NE反應(yīng)性和鈣敏感性明顯降低，量-效累積曲線明顯右移，Emax明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。缺血預(yù)處理和NS161

14、9預(yù)處理可明顯增加休克后期(休克3h)SMA對(duì)NE的反應(yīng)性和鈣敏感性，Emax明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.在休克后期(休克3h)，Rho激酶和RhoA活性較假手術(shù)組明顯下降，缺血預(yù)處理和NS1619預(yù)處理可明顯增加休克后期下降的Rho激酶活性和RhoA活性(P＜0.05)。Rho激酶抑制劑Y-27632(10-5mol/L)和RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(5μg/ml)可顯著抑制IPC和NS1619預(yù)處理對(duì)休克后

15、期(休克3h)血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用，使NE和Ca2+的累積量效曲線明顯右移，Emax明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。同時(shí)，RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(5μg/ml)可使IPC和NS1619預(yù)處理后增加的Rho激酶活性明顯下降(P＜0.01)。
　　5.與假手術(shù)組比較，PDZ-RhoGEF活性在休克后期(休克3h)明顯降低(P＜0.05)，p115-RhoGEF和LARG活性則無(wú)明顯變化(P＞0.05)。缺血預(yù)處理和

16、NS1619預(yù)處理可明顯增加休克后期下降的PDZ-RhoGEF活性(P＜0.05)。缺血預(yù)處理和NS1619預(yù)處理后PDZ-RhoGEF活性變化與缺血預(yù)處理和NS1619預(yù)處理后Rho激酶和RhoA活性變化之間呈直線正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1. IPC和BKCa通道開(kāi)放劑NS1619預(yù)處理具有對(duì)休克后期血管反應(yīng)性和鈣敏感性的保護(hù)作用，并最終改善失血性休克大鼠的存活率和存活時(shí)間。
　　2. RhoA/Rho激酶在IPC