衰老腎小管上皮細胞旁分泌TGF-β1促進上皮間充質(zhì)轉分化.pdf

1、目的:腎臟是隨衰老發(fā)生明顯結構和功能改變的重要器官之一。衰老腎臟主要組織病理學表現(xiàn)為:腎皮質(zhì)變薄、腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮及腎血管硬化。其中腎間質(zhì)改變被認為是導致衰老腎臟功能減退的主要原因，既往研究中發(fā)現(xiàn)衰老腎臟常伴隨腎臟纖維化，但是兩者之間的關系如何尚不清楚。上皮間充質(zhì)轉分化EMT是導致腎間質(zhì)纖維化的重要機制，因此，本課題利用體內(nèi)和體外腎臟衰老模型，擬探究腎臟衰老及間質(zhì)纖維化的關系，以及衰老腎臟EMT發(fā)生的可能機制，這對延

2、緩衰老腎臟損害及防治衰老相關腎臟疾病具有重要意義。
　　 方法:采用3月齡及24月齡F344雄性大鼠作為青年及老年大鼠模型，體內(nèi)實驗利用SA-β-gal染色、Masson染色檢測膠原纖維以及組織免疫熒光染E-cadherin、α-SMA明確大鼠腎臟衰老、腎間質(zhì)纖維化與EMT程度。體外實驗提取人原代近端腎小管上皮細胞，用高糖(33mM)分別刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h建立應激誘導腎小管上皮細胞衰老模型，通過Wes

3、ternblot檢測衰老相關標志物p53、p21及EMT指標E-cadherin、vimentin、α-SMA的表達變化，以明確腎小管上皮細胞衰老及EMT的關系;利用細胞免疫熒光方法觀察高糖刺激0h、24h、72h細胞E-cadherin、α-SMA的表達，動態(tài)觀察EMT指標的變化;為明確衰老腎小管上皮細胞是否通過衰老相關分泌表型(SASP)機制、分泌細胞因子促進鄰近細胞發(fā)生EMT;我們收集高糖刺激腎小管上皮細胞24h的細胞上清液(SE

4、N-CM)培養(yǎng)正常細胞48h，以正常細胞上清液(CM)作為對照，Westernblot檢測細胞EMT指標變化;利用siRNA干預p53抑制細胞衰老，收集高糖刺激24h后的細胞上清液SEN-CM(sip53)，培養(yǎng)正常細胞48h，分別以CM、SEN-CM、SEN-CM(si-con)作為對照，Westernblot檢測EMT指標表達變化，以證明抑制衰老后細胞是否發(fā)生EMT;為驗證衰老細胞是否通過旁分泌TGF-β1誘導鄰近細胞發(fā)生EMT，我

5、們利用ELISA試劑盒檢測CM、SEN-CM、SEN-CM(sip53)、SEN-CM(si-con)各組中的TGF-β1的含量，以驗證我們的假設;進一步通過TβR1I抑制TGF-β1/SMAD通路，觀察SMAD4、pSMAD3及EMT指標的表達變化，驗證SEN-CM確實能通過TGF-β1/SMAD通路發(fā)揮促EMT作用。
　　 結果:相比3月齡大鼠，24月齡大鼠腎小管出現(xiàn)明顯的SA-β-gal染色陽性，Masson染色示膠原纖維

6、染色陽性、組織免疫熒光發(fā)現(xiàn)腎小管E-cadherin表達下降、α-SMA表達升高，表明老年大鼠腎小管發(fā)生衰老、腎小管上皮細胞發(fā)生EMT及腎間質(zhì)纖維化。體外實驗，提取并培養(yǎng)人原代近端腎小管上皮細胞，高糖(33mM)誘導24h后出現(xiàn)SA-β-gal染色陽性，Westernblot顯示衰老相關標志物p53及p21表達逐漸增加，證實高糖刺激24h后腎小管上皮細胞發(fā)生細胞衰老表型(p＜0.05)。Westernblot顯示高糖刺激48h后E-ca

7、dherin表達逐漸下降，vimentin及α-SMA表達逐漸上升，且細胞的免疫熒光顯示，相比0h，高糖刺激72hE-caherin表達明顯下降，α-SMA表達明顯升高，說明高糖刺激48h后細胞出現(xiàn)EMT表型(p＜0.05)。因此，證實腎小管上皮細胞發(fā)生細胞衰老早于EMT。繼而我們推測衰老細胞可能通過旁分泌SASP促進鄰近細胞發(fā)生EMT，因此我們收集SEN-CM培養(yǎng)正常細胞48h，與CM組相比，SEN-CM組細胞E-cadherin表達

8、下降，vimentin及α-SMA表達升高，說明衰老細胞確實能夠通過旁分泌SASP促進鄰近細胞發(fā)生EMT。為驗證抑制衰老后是否能抑制SASP、減輕EMT的發(fā)生，我們利用siRNA技術抑制p53/p21衰老通路后發(fā)現(xiàn)，與SEN-CM組相比，SEN(sip53)組E-cadherin表達未見明顯下降，vimentin，α-SMA表達未見明顯增加，證實抑制腎小管上皮細胞衰老能減輕EMT發(fā)生。既往文獻報道TGF-β1在腎小管上皮細胞EMT過程中

9、起主要作用，為明確衰老細胞是否通過分泌TGF-β1促進鄰近細胞EMT，通過ELISA檢測CM、SEN-CM、SEN-CM(sip53)、SEN-CM(si-con)中的TGFβ1含量，發(fā)現(xiàn)與CM比較，SEN-CM的TGF-β1分泌增加，而SEN-CM(sip53)TGF-β1分泌增加不顯著，證實衰老細胞通過旁分泌TGF-β1促進相鄰細胞發(fā)生EMT，進而中和TGF-β1受體、抑制TGF-β1/SMAD通路后發(fā)現(xiàn)，相比SEN-CM組，本組細