TGF-β1-Smads-ILK信號通路在環(huán)孢素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:通過體外特異阻斷試驗,觀察TGF-β1/Smads信號通路在環(huán)孢素A致腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用,探討ILK是否作為TGF-β/Smads信號通路下游因子參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。
   方法:1.構(gòu)建ILK siRNA。2.大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)分設(shè)正常組及CsA誘導(dǎo)組,后者分別采用CsA不同濃度和時間處理,觀察細胞增殖抑制情況,選擇CsA最佳時間和最適濃度。3.將NRK52E細胞培養(yǎng)分為5組:空白對照

2、組(A組):僅加入含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基;CsA處理組(B組):細胞培養(yǎng)液加CsA(1mg/L);干預(yù)1組(C組):加TGF-β1阻斷劑(SB431542,10umol/L)預(yù)孵一小時后再加入CsA(1mg/L);干預(yù)2組(D組):轉(zhuǎn)染有效ILKshRNA(KD-ILKshRNA,劑量MOI=20)72h后加入CsA(1mg/L);干預(yù)3組(E組):轉(zhuǎn)染無效ILKshRNA(NC-ILKshRNA,劑量MOI=20)72h

3、后加入CsA(1mg/L)。上述各組分設(shè)3復(fù)孔,培養(yǎng)48 h。實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TGF-β1以及Smad2、Smad7、ILK、FSP-1mRNA的表達,蛋白印跡法(Western-blot)檢測TGF-β1、Smad7、ILK、FSP-1的蛋白表達。
   結(jié)果:1.從慢病毒載體pGCSIL-hU6/GFP-ILK-2中擴增、重組、酶切后獲得大約7800bp,DNA測序結(jié)果與Genbank中報道的I

4、LK基因序列一致。2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-52E細胞后可觀察GFP熒光表達,Western blot證實與GFP-ILK-2融合蛋白大小基本一致的陽性條帶;病毒滴度為1×109pfu/ml;RT-PCR檢測其對ILK基因表達的敲減效率>80%。3.TGF-β1mRNA及蛋白的表達情況:與A組比較,CsA處理后的各組細胞TGF-β1mRNA及蛋白表達量均顯著增加(P<0.01),其中C組、D組表達量顯著低于B組(P<0.01),C組的表達

5、量又顯著低于D組(P<0.01)而E組與B組表達量無顯著差異(P>0.05)。4.Smad2mRNA表達情況:與A組比較,CsA處理后的各組細胞Smad2mRNA表達量均顯著增加(P<0.01),其中C組、D組、E組表達量顯著低于B組(P<0.01),C組的表達量又顯著低于D、E組(P<0.01)。5.Smad7mRNA及蛋白的表達情況:與A組比較,CsA處理后各組細胞Smad7mRNA及蛋白表達量均顯著降低(P<0.05),其中C、D

6、、E組表達量均顯著高于B組(P<0.01),D、E組表達量又顯著低于C組(P<0.01)。6.ILKmRNA及蛋白的表達情況:與A組比較,CsA處理后的各組細胞ILKmRNA及蛋白表達量均明顯增加(P<0.01),C、D組表達增加程度顯著低于B組(P<0.01),E組與B組表達量無顯著差異(P>0.05),D組表達量顯著低于C組(P<0.01)。7.FSP-1mRNA及蛋白的表達情況:與A組比較,CsA處理后的各組細胞FSP-1mRNA

7、及蛋白表達量均顯著增加(P<0.05),C組、D組表達增加程度均顯著低于B組(P<0.01),E組表達量與B組無顯著差異(P>0.05),D組表達量顯著高于C組(P<0.01)。8.環(huán)孢素誘導(dǎo)腎小管細胞發(fā)生形態(tài)變化,并成時間劑量依賴關(guān)系。
   結(jié)論: TGF-β/Smads信號通路激活是環(huán)孢素A誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的重要機制之一,ILK作為TGF-β/Smads信號通路下游效應(yīng)因子參與(至少部分)參與環(huán)孢素A誘導(dǎo)大鼠腎

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