虎眼萬(wàn)年青總皂苷干預(yù)肝癌發(fā)生發(fā)展的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，防治工作還遠(yuǎn)不如人意?；⒀廴f(wàn)年青植物具有很好的抗腫瘤作用，體外實(shí)驗(yàn)研究顯示強(qiáng)大抑瘤效果。本研究為了探討虎眼萬(wàn)年青的抗肝癌作用及其機(jī)制，先建立大鼠肝癌病變模型后采用生物化學(xué)檢測(cè)法、病理形態(tài)學(xué)觀察法、免疫化學(xué)檢測(cè)法及PCR法等進(jìn)行研究，為虎眼萬(wàn)年青的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因?yàn)榛⒀廴f(wàn)年青皂苷（OSW-1）提取較難且昂貴，為此本研究以虎眼萬(wàn)年青提取物總皂苷進(jìn)行了防治肝癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　全文第一部分

2、首先研究了虎眼萬(wàn)年青總皂苷的提取工藝。結(jié)果顯示選擇8倍量85％乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)為最佳提取條件；收集45%-95%乙醇大孔吸附樹(shù)脂洗脫液，減壓濃縮，獲得精制總皂苷。其次因?yàn)榛⒀廴f(wàn)年青總皂苷成分較復(fù)雜，所以運(yùn)用所提取的虎眼萬(wàn)年青總皂苷進(jìn)行了毒理研究，結(jié)果顯示小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為3.2g/kg。最后制作了虎眼萬(wàn)年青總皂苷干預(yù)的二乙基亞硝胺誘發(fā)的大鼠肝癌病變模型，結(jié)果顯示14周開(kāi)始出現(xiàn)癌變，18周末成癌率100%，成活率6

3、0%。
　　全文第二部分研究了虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用于大鼠肝癌病變過(guò)程中血清學(xué)的影響。采用賴(lài)氏法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),采用鱟試劑基質(zhì)顯色法檢測(cè)內(nèi)毒素，用比色分析法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）的活性、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量。結(jié)果表明虎眼萬(wàn)年青總皂苷能有效降低肝細(xì)胞損傷敏感指標(biāo)AST、ALT活性及血漿內(nèi)毒素水平。MDA含量在肝癌病變的損傷硬化及發(fā)生發(fā)展階

4、段逐漸增高；虎眼萬(wàn)年青總皂苷具有降低MDA生成作用，尤以肝損傷硬化階段明顯。SOD在12周模型組顯著增高，與趨于正常組水平的模型14周、模型18周組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SOD活力在虎眼萬(wàn)年青作用的12周預(yù)防組低于12周模型組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在14周、18周虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用組與相應(yīng)模型組間，無(wú)顯著差異。說(shuō)明虎眼萬(wàn)年青總皂苷干預(yù)SOD活性水平發(fā)生在肝損傷硬化階段。GSH-Px活力在模型組12周、14周、18周逐漸下降，相互間有顯著性差異

5、。虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用組明顯提高GSH-Px活力，并與相應(yīng)的模型組間均有顯著性差異?；⒀廴f(wàn)年青總皂苷在促進(jìn)、發(fā)生發(fā)展階段中能夠增加大鼠血清 GSH-Px的活力，提高抗氧化系統(tǒng)功能，降低對(duì)毒物的敏感性。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血清中的NO濃度模型組14周時(shí)表達(dá)量最低，與各組間均有顯著性差異?；⒀廴f(wàn)年青總皂苷作用組14周時(shí)NO量明顯升高，且與14周模型組具有顯著性差異?；⒀廴f(wàn)年青總皂苷干預(yù)主要作用于肝癌發(fā)生階段。
　　全文第三部分動(dòng)態(tài)

6、觀察了虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用后的肝組織病理形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的變化。研究表明12周肝硬化階段模型組以出現(xiàn)增生結(jié)節(jié)，嗜堿性變，透明變，水變性為主；14周后模型組出現(xiàn)大量的“灶中灶”現(xiàn)象，18周模型組全部出現(xiàn)癌變。而虎眼萬(wàn)年青總皂苷預(yù)防組12周時(shí)減少嗜堿性細(xì)胞結(jié)節(jié)以出現(xiàn)少量假小葉、纖細(xì)纖維間隔、灶狀變性為主。14周預(yù)防組假小葉、不規(guī)則纖維間隔、肝細(xì)胞灶狀水變性、脂肪變性為主。14周治療組以部分處肝硬化、變性輕度為特點(diǎn)。18周肝癌治療組出現(xiàn)肝硬化

7、、增生結(jié)節(jié)、灶狀變性，同時(shí)癌周出現(xiàn)包裹性的囊腫。提示虎眼萬(wàn)年青總皂苷以癌周出現(xiàn)囊腫阻斷癌灶血液供應(yīng)而起到抑制肝癌發(fā)展。
　　肝癌前病變階段（14周）時(shí)線粒體部分空泡化、出現(xiàn)脂滴、嵴部分?jǐn)嗔选⒛[脹、變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。而虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用的預(yù)防組僅部分出現(xiàn)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)復(fù)合體。且虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用的治療組線粒體部分空泡化、出現(xiàn)脂滴、嵴部分?jǐn)嗔?，尚未出現(xiàn)線粒體變形及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張現(xiàn)象。在癌變進(jìn)展階段（18周）模型組肝癌細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)

8、邊集，細(xì)胞漿不均，線粒體固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、部分脫顆粒，癌旁細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生活躍；化療組癌細(xì)胞線粒體輕度腫脹、空泡化、脂滴、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核膜變形、染色質(zhì)分布不均，而癌旁細(xì)胞中溶酶體增多；而虎眼萬(wàn)年青總皂苷治療組癌細(xì)胞線粒體腫脹、空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張伴網(wǎng)池中大量顆粒，細(xì)胞漿疏松，出現(xiàn)大量溶酶體。
　　全文第四部分運(yùn)用免疫組化方法，動(dòng)態(tài)檢測(cè)肝組織標(biāo)本的Ki67、Flt-1的表達(dá)，并以虎眼萬(wàn)年青總皂苷干預(yù)。發(fā)現(xiàn)模型組、給藥組大鼠肝

9、組織Ki67指數(shù)（LI）升高明顯，并與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝癌變過(guò)程中以12周Ki67LI最高，說(shuō)明此階段肝細(xì)胞增生活躍，而虎眼萬(wàn)年青總皂苷干預(yù)此階段的肝細(xì)胞增生。至14周及18周模型組Ki67 LI逐漸降低，與12周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌以高分化為主有關(guān)。虎眼萬(wàn)年青總皂苷并不明顯干預(yù)14周及18周肝細(xì)胞增生，Ki67 LI與大鼠模型組統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異。模型組、給藥組均出現(xiàn)Flt-1指數(shù)（LI）增高，與

10、正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。誘癌14周模型組Flt-1 LI表達(dá)最高，虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用的14周預(yù)防組、治療組Flt-1 LI降低，且與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組12周、18周FI相對(duì)低下，與14周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在12周、18周虎眼萬(wàn)年青總皂苷作用組與相應(yīng)模型組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明肝癌誘發(fā)過(guò)程中以促進(jìn)期（14周）Flt-1表達(dá)較高，虎眼萬(wàn)年青總皂苷在此期干預(yù)Flt-1表達(dá)，防止肝癌的進(jìn)一步發(fā)展。
　　全文第五部分運(yùn)用實(shí)

11、時(shí)定量PCR檢測(cè)肝癌變過(guò)程中肝組織、肝癌組織、癌旁組織胰島素樣生長(zhǎng)因子-II（IGF-Ⅱ）和p16ink4a水平。結(jié)果顯示癌變前期肝組織中IGF-Ⅱ含量增加并不明顯，肝癌進(jìn)展階段肝癌組織中IGF-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌前期肝組織；虎眼萬(wàn)年青總皂苷在肝癌前期作用不大，而至肝癌進(jìn)展階段，虎眼萬(wàn)年青總皂苷治療的肝癌組織IGF-Ⅱ表達(dá)量明顯低于模型組的肝癌組織。說(shuō)明IGF-Ⅱ可能主要是通過(guò)肝細(xì)胞癌自分泌方式表達(dá)其水平，而虎眼萬(wàn)年青總皂苷治療組抑