4-1BB信號通路和薯蕷皂苷對實驗性矽肺發(fā)生發(fā)展的免疫調控機制研究.pdf

1、目的:全球范圍內，估計有數(shù)以百萬計的工人暴露于矽塵環(huán)境。這其中許多人接觸到的矽塵濃度都高于職業(yè)暴露限值。矽塵進入肺組織導致矽肺病，矽肺是塵肺的一種，它是一種漸進性職業(yè)性肺疾病。其特點是慢性肺部炎癥和不可逆的肺組織彌漫性纖維化?？蓪е禄颊呤趧幽芰ι踔了劳觯o社會造成沉重負擔。矽肺發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床缺乏特效治療方法。因此尋找矽塵導致肺纖維化進程中的關鍵分子，將其作為特異性分子靶點并探明其作用和機制將為肺纖維化疾病的治療和診斷提供

2、新線索。我們使用蛋白芯片技術觀察矽肺模型小鼠不同時期肺組織中蛋白表達譜的變化，選擇差異表達最明顯的4-1BB蛋白進行深入研究。探討其在矽塵導致肺組織纖維化中的可能作用機制，將為肺纖維化治療提供潛在靶標。
　　研究方法:本研究以實驗性矽肺模型小鼠為研究對象。通過氣管非暴露式灌注二氧化硅懸液，構建矽塵誘導小鼠肺纖維化動物模型。利用蛋白芯片篩查實驗，對矽塵暴露早期（7天）和晚期（56天）小鼠肺組織蛋白進行篩查實驗;得到肺組織差異變化蛋白

3、表達譜;得出矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白差異表達明顯。使用ELISA、Western blot、qRT-PCR、免疫組織化學等實驗方法進一步驗證4-1BB蛋白表達情況;通過生物信息學分析和通路分析得到與4-1BB蛋白相關的信號通路;選取通路中關鍵蛋白為靶點，阻斷4-1BB信號通路。使用H&E染色觀察阻斷信號通路對矽塵導致肺部炎癥的影響;使用Masson染色和羥脯胺酸測定，觀察阻斷信號通路對矽塵導致肺組織纖維化的影響;通過Weste

4、rn blot方法檢測信號通路阻斷情況;采用ELISA和CBA技術檢測各組小鼠肺泡灌洗液中相關炎性因子和小鼠肺組織蛋白中相關趨化因子的表達情況;通過流式細胞術檢測各組小鼠肺門淋巴結中T細胞分型情況及小鼠肺組織中循環(huán)纖維細胞聚集情況。應用qRT-PCR方法檢測小鼠肺組織中Th細胞免疫相關mRNA表達情況。
　　給予矽塵暴露小鼠不同劑量的薯蕷皂苷，應用Masson染色觀察薯蕷皂苷對于矽塵導致肺組織纖維化的影響;使用羥脯胺酸測定、wes

5、tern blot(Collagen-Ⅰ、FN-1)、qRT-PCR(Col-1、Fn-1)和免疫組織化學方法(Collagen-Ⅰ)確定薯蕷皂苷對矽塵導致肺組織纖維化的影響;通過H&E染色觀察薯蕷皂苷對矽塵導致肺部炎癥的影響，應用免疫熒光和免疫組織化學方法檢測薯蕷皂苷對于矽塵導致的肺部巨噬細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞聚集的影響;應用ELISA和CBA技術檢測小鼠肺泡灌洗液中相關細胞因子的含量。通過流式細胞術檢測各組小鼠肺門淋巴結中不同

6、類型輔助型T細胞所占比例及小鼠肺組織中循環(huán)纖維細胞聚集情況。使用qRT-PCR方法檢測小鼠肺組織中Th細胞免疫和循環(huán)纖維細胞相關趨化因子mRNA表達情況。
　　結果:
　　1、矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達增高。
　　與對照組相比，矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達增高。其中暴露后7天4-1BB蛋白表達增加770.86倍，暴露后56天4-1BB蛋白表達升高81.65倍。ELISA、western blot技

7、術、qRT-PCR和免疫組化檢測肺組織中4-1BB蛋白含量和mRNA表達情況，確定4-1BB在矽塵暴露組小鼠肺組織中高表達(p＜0.05)。
　　2、4-1BB融合蛋白阻斷4-1BB信號通路使ASK-1的磷酸化水平降低，NQDI1可以有效阻斷矽塵導致的肺部4-1BB信號通路激活。
　　通過體內體外實驗證明，給予矽塵暴露小鼠4-1BB融合蛋白，可以降低小鼠肺組織中ASK-1的磷酸化水平，并呈現(xiàn)劑量反應關系(p＜0.05)。給予

8、實驗動物NQDI1可以阻斷4-1BB信號通路，使信號通路下游蛋白p38和JNK的磷酸化水平下降，并且不影響實驗小鼠血清中AST、ALT含量。
　　3、阻斷4-1BB信號通路可以減輕矽塵導致的肺部炎癥和纖維化。
　　使用ASK-1特異性抑制劑阻斷4-1BB信號通路后，矽塵暴露導致的肺部炎癥明顯減輕。阻斷4-1BB信號通路可以使矽塵暴露導致的肺組織炎性細胞浸潤減輕，使小鼠肺泡灌洗液中炎性因子TNF-α含量降低(p＜0.05)，而

9、IL-6，IL-1β的含量不受影響。隨著疾病的進展，Masson染色顯示矽塵暴露晚期（56天）模型組小鼠肺組織出現(xiàn)細胞結節(jié)和膠原沉積。阻斷4-1BB信號通路可使矽塵暴露導致的肺纖維化減輕。羥脯胺酸含量測定和qRT-PCR(Col-1a1)結果進一步證明阻斷4-1BB信號通路可使矽塵暴露導致的肺纖維化減輕(p＜0.05)。
　　4、阻斷4-1BB信號通路可以影響肺部Th免疫應答。
　　在炎癥早期，阻斷4-1BB信號通路可以使肺

10、門淋巴結中Th1細胞占CD4+細胞的比例顯著降低(p＜0.05)。Th1細胞轉錄因子T-bet的mRNA水平降低(p＜0.05)，小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量降低(p＜0.05)。矽塵暴露晚期，阻斷4-1BB信號通路可以使矽塵暴露小鼠肺組織中GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA檢測結果顯示小鼠肺泡灌洗液中IL-13的含量有所下降，但差異不存在統(tǒng)計學差異。IL-4水平并沒有因阻斷4-1BB信號通路而改變。與矽塵暴露

11、組相比，阻斷4-1BB信號通路可以使小鼠肺門淋巴結中Th17細胞占CD4+細胞的比例降低(p＜0.05); Realtime-PCR檢測Th17細胞轉錄因子ROR-γ T的mRNA水平也因阻斷4-1BB信號通路而下降(p＜0.05); ELISA檢測結果顯示小鼠肺泡灌洗液中IL-17A的含量下降(p＜0.05)。矽塵暴露小鼠肺門淋巴結中調節(jié)性T細胞占CD4+細胞的比例升高(p＜0.05)。阻斷4-1BB信號通路使調節(jié)性T細胞所占的比例下

12、降(p＜0.05); CBA檢測結果顯示阻斷4-1BB信號通路后第3天和第7天小鼠肺泡灌洗液中IL-10含量沒有顯著變化，而在第56天有明顯下降(p＜0.05)。Realtime-PCR結果表明，阻斷4-1BB信號通路后第7天和第56天小鼠肺部TGF-β mRNA水平顯著下降(p＜0.05)。
　　5、阻斷4-1BB信號通路后纖維化減輕與循環(huán)纖維細胞向肺部聚集減少有關，相關趨化因子表達降低導致循環(huán)纖維細胞聚集減少。
　　流式

13、細胞術結果顯示阻斷4-1BB信號通路后，循環(huán)纖維細胞占肺組織細胞的比例下降(p＜0.05)。Realtime-PCR結果顯示矽塵暴露后小鼠肺組織中VCAM-1mRNA水平較對照組明顯上調(p＜0.05)，而ICAM-1的mRNA水平僅在矽塵暴露后7天顯著上調(p＜0.05)，而阻斷4-1BB信號通路并不能改變小鼠肺組織中兩分子mRNA水平。ELISA檢測肺組織中相關趨化因子的結果顯示矽塵暴露組小鼠與對照組小鼠相比，CCL-2、CCL-1

14、2和CCL-21顯著增高，而阻斷4-1BB信號通路后，這些趨化因子的含量均有所下降(p＜0.05)。阻斷信號通路也可以使SDF-1α的表達下降，但這種變化僅在第3天和第56天存在統(tǒng)計學差異。
　　6、薯蕷皂苷可以減輕矽塵導致的肺部炎癥和纖維化。
　　羥脯氨酸含量測定結果顯示，給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠較矽塵暴露組小鼠肺組織中膠原沉積明顯降低(p＜0.05)。各組小鼠肺組織石蠟切片進行Masson三色染色結果顯示給予矽塵暴露

15、小鼠薯蕷皂苷可以降低其肺部膠原沉積。Western blot結果顯示，給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠較矽塵暴露組小鼠肺組織中Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白水平有所下降(p＜0.05)。qRT-PCR結果顯示給予薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠肺組織中Col-1a1和Fn-1 mRNA水平下降(p＜0.05)。免疫組織化學染色結果表明Ⅰ型膠原蛋白在小鼠肺組織中的沉積隨給予薯蕷皂苷劑量的增加而減少(p＜0.05)。
　　7、薯蕷皂苷可以減輕矽塵導致的肺

16、部炎細胞的聚集。
　　H&E染色結果顯示，矽塵暴露組小鼠表現(xiàn)出嚴重的肺部炎癥，而在給予薯蕷皂苷治療后肺部炎癥反應減輕，并呈現(xiàn)劑量反應關系。ELISA和CBA方法檢測肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)與矽塵暴露組相比，給予薯蕷皂苷治療的矽塵暴露組小鼠肺泡灌洗液中相關促炎因子含量減少，變化與給予薯蕷皂的劑量存在劑量反應關系(p＜0.05)。qRT-PCR結果表明小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA

17、水平變化與之前ELISA檢測結果趨勢相一致。免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，矽塵暴露組小鼠肺組織切片中存在大量巨噬細胞聚集，而給予薯蕷皂苷使巨噬細胞的數(shù)量顯著下降。qRT-PCR結果顯示，給予高劑量(80 mg/kg)薯蕷皂苷的矽塵暴露組小鼠肺組織中CD68 mRNA水平明顯降低(p＜0.05)。免疫熒光結果顯示，矽塵暴露肺組織中B淋巴細胞(B220+)數(shù)量明顯增加，給予薯蕷皂苷治療后矽塵暴露導致的B細胞聚集有所降低。免疫組化結果顯示矽塵暴露的肺

18、組織中T細胞聚集增加，薯蕷皂苷治療后T細胞聚集減少。
　　8、薯蕷皂苷可以調節(jié)矽塵誘導的肺部Th免疫應答。
　　流式細胞術檢測顯示，矽塵暴露組和對照組相較，肺門淋巴結中Th1和Th17細胞占CD4+T細胞比例顯著增加，給予高劑量薯蕷皂苷后Th1細胞和Th17細胞比例有所下降。ELISA檢測肺泡灌洗液中相關炎性因子含量，結果表明給予薯蕷皂苷可以使矽塵暴露早期Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(p＜0.05)，并可抑制

19、Th2型細胞因子IL-4和IL-13的表達(p＜0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示薯蕷皂苷可以使肺組織中Th1和Th2型細胞轉錄因子T-bet和GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA檢測表明與單純矽塵暴露組相比，給予薯蕷皂苷治療的矽塵暴露小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量有所下降(p＜0.05)。
　　9、薯蕷皂苷的抗纖維化作用與循環(huán)纖維細胞向肺組織聚集減少有關。
　　免疫熒光結果顯示矽塵暴露組小鼠肺組織中

20、有較多循環(huán)纖維細胞聚集，給予薯蕷皂苷可以明顯減少矽塵暴露導致的循環(huán)纖維細胞聚集。流式細胞術結果顯示矽塵暴露可以導致肺部循環(huán)纖維細胞聚集增加，而給予薯蕷皂苷可以使其聚集減少。qRT-PCR結果顯示給予薯蕷皂苷可以使肺組織中CCL12和CCL19 mRNA水平降低(p＜0.05)，而不能改變CCL21和CXCL12 mRNA水平。
　　10、薯蕷皂苷通過調控TGF-β-Smad3信號通路減輕矽塵對肺泡上皮細胞的損傷。
　　H&E

21、染色結果顯示，矽塵暴露組小鼠給予薯蕷皂苷7天后，肺組織結構損傷明顯減輕。流式細胞術結果表明，肺組織矽塵暴露后EpCAM+FSP-1+雙陽細胞數(shù)量明顯增多，給予薯蕷皂苷治療使這部分雙陽性細胞數(shù)量明顯減少(p＜0.05)。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)矽塵暴露組小鼠肺組織中上皮細胞標記物Occludin(Ocln)、E-Cadherin(Cdh1)和Sf tpc mRNA水平較對照組明顯下降(p＜0.05)，而間質細胞標記物Vimentin(Vim

22、)和FSP-1 mRNA表達水平明顯上升(p＜0.05);免疫熒光染色結果顯示矽塵暴露導致肺組織上皮細胞標志E-cadherin表達減弱，而薯蕷皂苷治療可以恢復矽塵導致的上皮細胞標記的損失。矽塵暴露小鼠肺組織中N-cadherin表達升高，給予薯蕷皂苷可以抑制其表達升高。Western Blot檢測結果顯示矽塵暴露小鼠肺組織中Vimentin的表達升高，而給予薯蕷皂苷可以劑量依賴性的減少其表達。
　　qRT-PCR結果表明薯蕷皂苷

23、處理能夠降低矽塵暴露小鼠肺組織中Tgfβ mRNA水平(p＜0.05)。Western blot結果顯示矽塵暴露小鼠肺組織蛋白中TGF-β表達升高，給予薯蕷皂苷可以降低其表達。Western blot結果顯示薯蕷皂苷處理可以抑制矽塵誘導的肺部Smad3磷酸化，而不影響總Samd3水平。
　　流式細胞分析結果顯示矽塵暴露組小鼠肺門淋巴結中調節(jié)性T細胞比例較對照組明顯升高(p＜0.05)，薯蕷皂苷治療可以降低其比例(p＜0.05)。q

24、RT-PCR結果顯示薯蕷皂苷處理可以明顯降低矽塵暴露組小鼠肺組織中IL-10和Foxp3mRNA水平(p＜0.05)。
　　結論:1、矽塵暴露小鼠肺組織中4-1BB蛋白表達增高。2、阻斷4-1BB信號通路可以減輕矽塵導致的肺部炎癥和纖維化。3、阻斷4-1BB信號通路可以減輕肺部Th免疫應答和循環(huán)纖維細胞向肺部的聚集進而減輕肺纖維化。4、薯蕷皂苷通過減少巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞向肺部的聚集，減輕肺部炎癥。5、薯蕷皂苷通過調節(jié)