單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體在小鼠心肌梗死治療中的應(yīng)用.pdf

1、間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromalcellderivedfactor-1)是一種趨化因子,它和主要受體CXCR4相互作用,介導(dǎo)干細(xì)胞歸巢、抑制細(xì)胞凋亡等。心肌梗死后,內(nèi)源性SDF-1分泌在表達(dá)量和持續(xù)時(shí)間上無法滿足心肌梗死后機(jī)體修復(fù)的需求。本研究構(gòu)建了單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體,體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)論證這個(gè)單質(zhì)粒警戒載體的優(yōu)越性。同時(shí),探討SDF-1抑制缺氧引起心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　第一部分SDF-1基因治療對H9C

2、2、間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞的影響
　　[目的]掌握分離間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞的方法;使用H9C2細(xì)胞模擬心肌細(xì)胞,研究SDF-1基因治療后SDF-1在缺氧心肌內(nèi)的表達(dá)時(shí)間曲線;研究SDF-1能否抑制缺氧應(yīng)激引起的H9C2、間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞凋亡;探討這種抑制作用與p-Bad蛋白去磷酸化為Bad的關(guān)系。
　　[方法]分離、培養(yǎng)MSCs、CSCs。構(gòu)建pCMV-hSDF-1-GFP質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到缺氧的H9C2細(xì)胞,Rea

3、l-timePCR、細(xì)胞染色驗(yàn)證轉(zhuǎn)染。Western-blot法檢測SDF-1的表達(dá)時(shí)間曲線。在SDF-1表達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)(轉(zhuǎn)染后3天)收集條件培養(yǎng)基,以缺氧后內(nèi)源性SDF-1表達(dá)高峰培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基。對比兩種培養(yǎng)基對MSCs、CSCs遷移的影響。分析兩種培養(yǎng)基對H2O2模擬的缺氧應(yīng)激引起的H9C2、MSCs、CSCs凋亡的影響(細(xì)胞活力試驗(yàn)、臺盼藍(lán)拒染法實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)),并進(jìn)一步觀察SDF-1條件培養(yǎng)基對在這個(gè)過程中p-Bad蛋白去磷

4、酸化為Bad蛋白的影響。[結(jié)果]pCMV一hSDF-1-GFP轉(zhuǎn)染缺氧的H9C2細(xì)胞后,hSDF-1基因表達(dá)是對照組的31倍(p＜0.01),轉(zhuǎn)染效率在27.83％±2.61％。SDF-1蛋白在轉(zhuǎn)染后3-7天達(dá)到表達(dá)高峰,即使14天后SDF-1的表達(dá)還較缺氧后內(nèi)源性SDF-1表達(dá)高峰明顯。條件培養(yǎng)基較對照培養(yǎng)基促進(jìn)了MSCs、CSCs的遷移:CSCs34±11vs.11±3,p＜0.001:MSCs56±4vs.10±1,p＜0.001

5、。細(xì)胞活力試驗(yàn):條件培養(yǎng)基組共聚焦顯微鏡下H9C2、MSCs、CSCs中綠色細(xì)胞比例較對照培養(yǎng)基組綠色細(xì)胞比例高。臺盼藍(lán)拒染法實(shí)驗(yàn):MSCs(條件培養(yǎng)基組84％±7％vs.對照培養(yǎng)基組60％±2％,P＜0.01);CSCs(條件培養(yǎng)基組82％±3％vs.對照培養(yǎng)基組62％±3％,P＜0.001);H9C2(條件培養(yǎng)基組89％±3％vs.對照培養(yǎng)基組65％±2％,P＜0.001)。形態(tài)學(xué)上觀察H9C2、MSCs、CSCs細(xì)胞的區(qū)別:對照培

6、養(yǎng)基組可以觀察到更多的圓形、光亮的細(xì)胞。不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)后,Western-blot結(jié)果:條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)的H9C2、MSCs、CSCs細(xì)胞p-Bad的表達(dá)較對照組明顯,Bad蛋白則相反。細(xì)胞染色:在共聚焦顯微鏡下,條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)的H9C2、MSCs、CSCs細(xì)胞可以觀察到p-Bad的表達(dá)。
　　[結(jié)論]pCMV-hSDF-1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染缺氧H9C2細(xì)胞后,SDF-1高表達(dá)持續(xù)超過14天,高峰在3-7天?；蛑委煹腟DF-1

7、條件培養(yǎng)基可以通過減少p-Bad去磷酸為Bad抑制缺氧引起的H9C2、MSCs、CSCs凋亡?；蛑委煹腟DF-1條件培養(yǎng)基明顯促進(jìn)了MSCs、CSCs的遷移。
　　第二部分單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體在小鼠心肌梗死治療中的應(yīng)用
　　[目的]構(gòu)建單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體,體外、體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證這個(gè)載體系統(tǒng)的有效性。探討SDF-1抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　[方法]構(gòu)建單、雙質(zhì)粒心肌特異性缺

8、氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體,Real-timePCR對比單雙質(zhì)粒載體hSDF-1的表達(dá)。分離原代心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染單質(zhì)粒載體,對比正常氧、低氧下hSDF-1的表達(dá)。探尋單質(zhì)粒載體啟動的時(shí)間。疊氮鈉模擬缺氧應(yīng)激,單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后,觀察心肌細(xì)胞的生存,提取條件培養(yǎng)基,用AMD3100阻斷SDF-1和CXCR4的相互作用,分為Control、AMD3100、AMD3100+條件培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基組,分析SDF

9、-1抑制心肌細(xì)胞時(shí)是否磷酸化Akt、p-38MAPK、ERK1/2。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證單質(zhì)粒警戒載體能否實(shí)現(xiàn):高效、心肌特異性、缺氧警戒,分為Control組、MI組、假手術(shù)+V(警戒載體)組、MI+V組,在心肌梗死后1天分析SDF-1在肝臟、假手術(shù)+V組心肌、MI+V組心肌的表達(dá),同時(shí)Western-blot和免疫組化法分析心肌組織p-Akt、p-ERK1/2、p-38MAPK、p-Bad的表達(dá),TUNEL實(shí)驗(yàn)評價(jià)體內(nèi)心肌細(xì)胞的凋亡。7天后

10、小動物心超分析各組心功能各項(xiàng)參數(shù):EF％(左室射血分?jǐn)?shù))、LVmass(左室壁心肌重量)、FS％(短軸縮短率)等,通過Masson染色評價(jià)心肌纖維化。
　　[結(jié)果]成功構(gòu)建單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體,該載體在缺氧條件下hSDF-1基因表達(dá)是雙質(zhì)粒載體的2.5倍(p＜0.01)。單質(zhì)粒SDF-1載體在低氧后30分鐘,hSDF-1基因開始表達(dá)上調(diào)(是正常氧濃度下hSDF-1基因的1.5倍),缺氧24小時(shí)后對比非缺氧條件

11、上升8.6倍(p＜0.01)。單質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞效率在55％±7％;原代心肌細(xì)胞分為Normal組,Model組(疊氮鈉),SDF組,SDF+疊氮鈉組:Normal、Model、SDF組原代心肌細(xì)胞在第3天開始出現(xiàn)部分心肌細(xì)胞死亡,第5天心肌細(xì)胞完全死亡;在SDF+疊氮鈉組觀察到原代心肌細(xì)胞在第9天才開始出現(xiàn)部分心肌細(xì)胞死亡,第11天培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞完全死亡。對比Control、AMD3100、AMD3100+條件培養(yǎng)基組,S

12、DF-1條件培養(yǎng)基組明顯增加了p-Akt、p-ERK1/2、p-38MAPK的表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn):單質(zhì)粒載體治療組心肌組織的SDF-1較非治療組表達(dá)明顯,也較治療組肝臟組織的SDF-1表達(dá)明顯;Western-blot、免疫組化染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明治療組p-Akt、p-ERK1/2、p-38MAPK、p-Bad都較未治療組高表達(dá);單質(zhì)粒載體治療組心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)25±2較非治療組43+8明顯少,P＜0.01。7天后,心超測定心功

13、能:MI+V組心功能較MI組明顯改善,MI+V組和MI組:EF％,36.68±5.21VS21.1±2.12,p＜0.01;LVMass,102.85±9.90VS151.90±9.08,p＜0.01:FS％,17.42±2.22VS10.05±0.50,p＜0.01。Masson染色結(jié)果表明:單質(zhì)粒載體治療組纖維化面積較未治療組縮小。
　　[結(jié)論]本課題構(gòu)建的單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體具備高效、缺氧警戒、心肌特異