心肌特異性miRNA在缺血后處理心肌保護機制中的作用.pdf

1、一.背景
　　 近年發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA,miRNA)在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類非編碼的小分子單鏈RNA，其序列在物種間高度保守。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平特異性識別靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上相應靶點，并通過堿基互補配對方式與之結合，從而抑制特定的靶基因而發(fā)揮作用。抑制方式取決于miRNA與靶點互補結合的程度，完全互補結合常導致靶基因降解，不完全互補結合則抑制靶蛋白翻譯。據(jù)推測，人類大

2、約1/3基因可能受miRNA的調(diào)控，但目前只有少部分miRNA功能得到闡明。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的表達存在著組織特異性，如心肌特異性的miRNA有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-206、miRNA-199等。近幾年的研究表明，心肌特異性miRNA參與了心臟發(fā)育、細胞凋亡、心律失常、心肌肥厚及心力衰竭等多種心臟生理和病理過程，調(diào)控這些miRNA的表達可減輕甚至逆轉(zhuǎn)上述病理過程。
　　 缺血再灌注(I

3、schemic Reperfusion，IR)損傷機制及心肌保護的研究仍然是當今熱門的課題。1986年，Murry等首次發(fā)現(xiàn)在離體狗的缺血再灌注模型中對缺血心肌進行短暫的缺血再灌注處理，能在隨后的長時間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預處理(Ischemic Preconditioning，IPC)，該效應在多種動物模型中得到證實。但由于臨床上無法預測何時發(fā)生缺血，所以其在臨床應用中受到較大的限制。2003年VintenJohansen

4、實驗室首次提出了缺血后處理(Ischemic Postconditioning, IPost)的概念。缺血后處理是在已缺血心肌的再灌注早期給予短暫、多次的缺血干預，其對心肌保護作用表現(xiàn)為梗死面積減小、加快心肌功能恢復、保護心肌超微結構及減少再灌注后心律失常的發(fā)生等。目前對缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的機制研究主要集中在其抑制心肌細胞凋亡的分子信號轉(zhuǎn)導方面。以往的報道顯示miRNA可能與心肌細胞凋亡有關，而缺血后處理已經(jīng)被證明能夠減少

5、心肌細胞凋亡，我們推測miRNA有可能參與了缺血后處理心肌保護過程。
　　 二.目的
　　 本實驗以大鼠在體心臟缺血后處理模型和心肌細胞缺氧復氧模型為研究對象，重點探討缺血再灌注損傷對心肌特異性miRNA表達的調(diào)控以及心肌特異性miRNA在缺血后處理心肌保護機制中可能發(fā)揮的作用，以期為臨床圍手術期的心肌保護提供新的理論和可能的治療方法。
　　 1.通過建立大鼠在體心臟缺血后處理實驗模型，探討缺血后處理對整體心肌缺

6、血再灌注損傷的保護作用；
　　 2.研究缺血后處理對心肌特異性miRNA表達的影響，探討缺血后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護機制；
　　 3.通過建立心肌細胞缺氧復氧模型，在細胞水平進一步研究心肌特異性miRNA對心肌細胞凋亡的影響。
　　 三.方法
　　 1.采用左冠狀動脈結扎法制作大鼠在體心臟缺血后處理模型；將動物隨機分為sham組(對照組)、IR組(缺血再灌注組)及IP組(缺血后處理組)。行左心室和

7、股動脈插管，監(jiān)測記錄平均動脈壓(MAP)、心率(HR)、左室收縮峰壓(LVSP)、左室內(nèi)壓力變化最大速率(±dp/dtmax)以及再灌注后心律失常(室性心動過速和心室纖維顫動)發(fā)生率。取靜脈血，測定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量；取大鼠心臟，分別采用TTC法測定心肌梗死體積；TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率；在電鏡下觀察心肌細胞超微結構的改變。
　　 2.取心肌組織作基因芯片檢測，篩選出缺血再灌注組較對照組表達明顯改變

8、且心肌特異性表達的miRNA，并行RT-PCR驗證，測定各組中這些心肌特異性miRNA的表達水平。
　　 3.用差速貼壁分離純化方法培養(yǎng)心肌細胞，建立心肌細胞缺氧復氧模型；分別應用上述實驗已經(jīng)證實表達有差異的miRNA-1和miRNA-133的模擬劑和抑制劑進行干預；將培養(yǎng)細胞分為A組(缺血再灌注組)、B組(缺血再灌注+miRNA-1 mimic組)、C組(缺血再灌注+miRNA-1 inhibitor組)、D組(缺血再灌注+m

9、iRNA-133mimic組)和E組(缺血再灌注+miRNA-133 inhibitor組)，應用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡發(fā)生情況。
　　 四.結果
　　 1.在大鼠在體心臟缺血后處理模型中，與對照組相比，缺血再灌注組的HR(306±14次/分vs396±15次/分)、MAP(81.21±3.83mmHg vs101.38±4.26mmHg)、LVSP(103.04±4.40mmHg vs135.78±6.06mmHg

10、)、+dp/dtmax(3.31±0.19mmHg/svs5.78±0.34 mmHg/s)以及-dp/dtmax(2.82±0.13mmHg/s vs4.43±0.26 mmHg/s)均顯著下降(P＜0.05)；缺血后處理組中HR(337±16次/分)、MAP(89.44±4.70mmHg)、LVSP(113.65±5.72 mmHg)、+dp/dtmax(3.91±0.24 mmHg/s)以及-dp/dtmax(3.08±0.18

11、mmHg/s)較缺血再灌注組顯著增加(P＜0.05)；對照組未發(fā)生心律失常，與缺血再灌注組比較缺血后處理組VT(50％vs100％)及VF(12.5％vs75％)發(fā)生率均顯著降低(P＜0.05)；缺血后處理組血清中CK(120.00±6.58U/L)及LDH(50.15±2.65U/L)含量明顯低于缺血再灌注組(CK135.29±7.17U/L、LDH64.79±3.05U/L，P＜0.05)同時高于對照組(CK54.94±2.13U/

12、L、LDH34.15±1.22U/L，P＜0.05)；對照組未檢測到心肌梗死，缺血后處理組(13.40±0.95％)心肌梗死指數(shù)較缺血再灌注組(27.64±1.51％)明顯下降(P＜0.05)；缺血后處理組(20.81±1.23％)心肌細胞凋亡率明顯低于缺血再灌注組(44.62±4.59％，P＜0.05)同時高于對照組(6.70±0.87％，P＜0.05)；電鏡觀察，較對照組缺血再灌注組心肌細胞有明顯破壞，缺血后處理后心肌破壞程度減輕。

13、提示缺血再灌注對心肌細胞產(chǎn)生損傷，而缺血后處理可以減輕缺血再灌注誘發(fā)的損傷。
　　 2.基因芯片篩選結果顯示，與對照組相比，缺血再灌注組中心肌特異性表達的miRNA-1(51964.34±1954.28 vs24454.18±987.64)和miRNA-133(4705.42±223.85 vs2362.14±1013.29)的表達量均顯著下調(diào)(P＜0.05)，提示缺血再灌注損傷有可能與心肌特異性的miRNA-1和miRNA-1

14、33的表達水平降低有關；進一步采用RT-PCR檢測，結果顯示，與缺血再灌注組相比，缺血后處理組中miRNA-1和miRNA-133的表達量分別升高了1.415倍和1.463倍，提示缺血后處理可相對增加miRNA-1和miRNA-133的表達量，并可能與凋亡的減少有關。
　　 3.在心肌細胞缺氧復氧模型中，與A組(17.34±1.19％)相比，B組(13.25±0.90％)和D組(12.40±0.82％)心肌細胞凋亡率均顯著降低(

15、P＜0.05)，提示應用miRNA-1和miRNA-133模擬劑可以部分抑制缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡；C組(20.71±1.48％)和E組(20.87±1.66％)心肌細胞凋亡率均顯著增高(P＜0.05)，提示應用miRNA-1和miRNA-133抑制劑可能會進一步加重缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的發(fā)生。
　　 五.結論
　　 1.心肌缺血再灌注可抑制心肌特異性的miRNA-1和miRNA-133表達并可導致心肌細胞