人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性及其相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及意義：嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨病等原因所致的骨缺損在臨床治療中非常常見，治療方法主要有自體骨移植、異體或異種骨移植、生物材料填充等。自體骨移植是治療骨缺損最有效的方法及金標(biāo)準(zhǔn)，但自體骨往往不能滿足較大骨缺損對(duì)植骨量的要求，同時(shí)會(huì)造成供骨區(qū)新的創(chuàng)傷；而異體或異種骨移植以及生物材料等均難以獲得滿意的療效。近年來組織工程骨的研究為骨缺損修復(fù)帶來了新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowderivedmesenchymalst

2、emcells，MSCs)被認(rèn)為是骨組織工程最佳的種子細(xì)胞。因?yàn)檫@種細(xì)胞取材方便，可通過穿刺獲得，創(chuàng)傷小，取材后并發(fā)癥少，細(xì)胞培養(yǎng)增殖快，在體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)環(huán)境下可分化為骨組織，而且具有多向分化潛能。 盡管自體MSCs或成骨細(xì)胞用于動(dòng)物及臨床個(gè)體化治療已經(jīng)取得了良好的結(jié)果，但MSCs在骨髓中含量很少，并隨著年齡的增長(zhǎng)減少；現(xiàn)有方法體外迅速擴(kuò)增困難；而且一些自身免疫性疾病患者，其MSCs增殖能力明顯減弱；且隨著培養(yǎng)代數(shù)增加可能出現(xiàn)“

3、反分化”現(xiàn)象和致瘤性，從而失去了細(xì)胞應(yīng)有的功能和安全性。因此，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用會(huì)受來源和數(shù)量限制，難以滿足臨床“隨取隨用”的要求。建立同種異體MSCs種子細(xì)胞庫是解決這些問題的捷徑，也是組織工程從實(shí)驗(yàn)室走向產(chǎn)業(yè)化的重要前提。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，已往低等級(jí)動(dòng)物模型也證明同種異體種子細(xì)胞及其構(gòu)建的組織工程肌腱、軟骨、骨組織植入體內(nèi)免疫反應(yīng)輕微，不足以影響工程化組織植入體內(nèi)后的修復(fù)功能，但對(duì)經(jīng)成骨誘導(dǎo)和經(jīng)

4、炎前因子處理后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。 本課題主要研究經(jīng)成骨誘導(dǎo)和炎前因子處理后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性，探討其是否具有免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為同種異體MSCs產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及最終走向臨床打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?(1)從人骨髓中分離培養(yǎng)hMSCs并在體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行觀察； (2)應(yīng)用流式、RT-PCR和WB研究hMSCs、DOC免疫原性及經(jīng)IFN-γ處理后其免疫原性

5、的變化； (3)應(yīng)用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)研究hMSCs、DOC及經(jīng)IFN-γ，處理后在不同數(shù)量、不同刺激條件、不同天數(shù)下對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)增殖的影響；應(yīng)用ELISA研究hMSCs、DOC及經(jīng)IFN-γ處理后細(xì)胞因子分泌情況，探討hMSCs免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，從而了解以hMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建的同種異體組織工程移植的可行性。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性 (1)無菌條件下在志愿

6、者髂嵴處穿刺抽取20ml骨髓，經(jīng)密度梯度離心分離純化hMSCs，培養(yǎng)在含15％胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)液里。 (2)比較hMSCs及DOC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期。 (3)FACS檢測(cè)第3代hMSCs、DOC(誘導(dǎo)后第6、12、18天)細(xì)胞的CD14、CD29、CD34，CD44、CD45、CD105，CD166表達(dá)。 (4)用四環(huán)素法、茜素紅法；Ⅰ型膠原、骨鈣素免疫組化染色鑒定DOC。 2.人骨髓間

7、充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性實(shí)驗(yàn)研究 (1)以未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)為對(duì)照，采用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ等免疫相關(guān)分子的表達(dá)； (2)采用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的B7-H1、B7

8、-H4、HLA-B、HLA-DRA、HLA-DRB等免疫相關(guān)基因表達(dá)情況； (3)采用WB技術(shù)分別檢測(cè)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的B7-H1、B7-H4等免疫相關(guān)因子表達(dá)情況； 3.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究 應(yīng)用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)觀察： (1)不同數(shù)量級(jí)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+I

9、FN-γ，對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs刺激的PBMCs增殖的影響； (2)不同數(shù)量級(jí)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對(duì)經(jīng)有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖的影響； (3)不同天數(shù)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs和PHA刺激的PBMCs增殖的影響； (4)應(yīng)用ELISA檢測(cè)hMSCs、hMSCs+IFN

10、-γ，和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+IFN-γ，其培養(yǎng)上清IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1和PGE2的表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性 (1)細(xì)胞呈紡錘形或三角形，類似纖維細(xì)胞，旋渦樣排列；原代hMSCs接種后4d，可觀察到成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落，9至12d長(zhǎng)滿單層培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞4至7d長(zhǎng)滿單層；hMSCs及DOC細(xì)胞貼壁率無明顯差別，生長(zhǎng)曲線hMSCs倍增

11、時(shí)間為38.1h，DOC為39.7h。hMSCs和DOC細(xì)胞周期比較，hMSCs細(xì)胞周期中S+G2比例較多，G1比例較少。表明：hMSCs生長(zhǎng)增殖速度較DOC快。 (2)第3代細(xì)胞FACS檢測(cè)結(jié)果顯示：分離培養(yǎng)的細(xì)胞CD29、CD44、CD105、CD166表達(dá)強(qiáng)陽性，而CD14、CD34、CD45陰性。 (3)成骨誘導(dǎo)16d，四環(huán)素、茜素紅染色見到團(tuán)塊狀細(xì)胞中有鈣鹽沉積；Ⅰ型膠原、骨鈣素免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)見到胞漿內(nèi)有大量

12、的棕黃色顆粒。 2.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性實(shí)驗(yàn)研究 (1)FACS檢測(cè)結(jié)果顯示：與hMSCs組比較，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組HLA-Ⅰ表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，HLA-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。 (2)RT-PCR結(jié)果顯示：與hMSCs組比較，DOC組表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組B7-H1、B7-H4、HLA-B、HLA-DRA、HLA-DRB表

13、達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。 (3)WB結(jié)果顯示：與hMSCs組比較，DOC18天組、DOC+IFN-γ組B7-H1表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)；DOC12天組、hMSCs+IFN-γ組B7-H4表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ，組B7-H4表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。 3.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究 (1)應(yīng)用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)觀察:①實(shí)驗(yàn)組數(shù)量級(jí)hM

14、SCs、hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)，其中105組與103組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.01)。②不同數(shù)量級(jí)hMSCs和誘導(dǎo)后第18天的DOC對(duì)經(jīng)有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。與陽性對(duì)照組相比，在103數(shù)量級(jí)，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組對(duì)經(jīng)有絲

15、分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖無抑制作用；hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC+IFN-γ對(duì)經(jīng)有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。③與陽性對(duì)照組相比，不同天數(shù)hMSCs和誘導(dǎo)后第18天的DOC對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，第6天抑制作用最強(qiáng)；與陽性對(duì)照組相比，在第4、6、8天，hMSCs+IFN-γ和誘導(dǎo)后第18天的DOC+I

16、FN-γ對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，第8天抑制作用最強(qiáng)；在第2天，hMSCs+IFN-γ和DOC+IFN-γ對(duì)經(jīng)同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均無抑制作用。 (2)應(yīng)用ELISA檢測(cè)hMSCs、hMSCs+IFN-γ，和誘導(dǎo)后第18天的DOC、DOC+IFN-γ培養(yǎng)上清，均能分泌IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1和PGE2；與未

17、經(jīng)IFN-γ刺激組相比，IFN-γ刺激組各細(xì)胞因子分泌水平均顯著增高(P＜0.01)。 結(jié)論： (1)采用密度梯度離心分離人骨髓獲得的細(xì)胞在形態(tài)、表面標(biāo)志、多向分化能力方面都符合hMSCs的特征，在成骨誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞分化，表達(dá)Ⅰ型膠原和骨鈣素，是骨組織工程較理想的種子細(xì)胞。 (2)體外實(shí)驗(yàn)表明MSCs、DOC保持低免疫原性，在炎前細(xì)胞因子(IFN-γ)刺激下其免疫原性增強(qiáng)。 (3)hMSCs、hM