人骨髓間充質干細胞免疫原性及其相關機制的實驗研究.pdf

1、研究背景及意義：嚴重創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨病等原因所致的骨缺損在臨床治療中非常常見，治療方法主要有自體骨移植、異體或異種骨移植、生物材料填充等。自體骨移植是治療骨缺損最有效的方法及金標準，但自體骨往往不能滿足較大骨缺損對植骨量的要求，同時會造成供骨區(qū)新的創(chuàng)傷；而異體或異種骨移植以及生物材料等均難以獲得滿意的療效。近年來組織工程骨的研究為骨缺損修復帶來了新的希望。骨髓間充質干細胞(bonemarrowderivedmesenchymalst

2、emcells，MSCs)被認為是骨組織工程最佳的種子細胞。因為這種細胞取材方便，可通過穿刺獲得，創(chuàng)傷小，取材后并發(fā)癥少，細胞培養(yǎng)增殖快，在體內外成骨誘導環(huán)境下可分化為骨組織，而且具有多向分化潛能。 盡管自體MSCs或成骨細胞用于動物及臨床個體化治療已經取得了良好的結果，但MSCs在骨髓中含量很少，并隨著年齡的增長減少；現(xiàn)有方法體外迅速擴增困難；而且一些自身免疫性疾病患者，其MSCs增殖能力明顯減弱；且隨著培養(yǎng)代數(shù)增加可能出現(xiàn)“

3、反分化”現(xiàn)象和致瘤性，從而失去了細胞應有的功能和安全性。因此，自體骨髓間充質干細胞的應用會受來源和數(shù)量限制，難以滿足臨床“隨取隨用”的要求。建立同種異體MSCs種子細胞庫是解決這些問題的捷徑，也是組織工程從實驗室走向產業(yè)化的重要前提。近年來，國內外研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有免疫調節(jié)作用，已往低等級動物模型也證明同種異體種子細胞及其構建的組織工程肌腱、軟骨、骨組織植入體內免疫反應輕微，不足以影響工程化組織植入體內后的修復功能，但對經成骨誘導和經

4、炎前因子處理后骨髓間充質干細胞的免疫原性及免疫調節(jié)機制知之甚少。 本課題主要研究經成骨誘導和炎前因子處理后骨髓間充質干細胞的免疫原性，探討其是否具有免疫調節(jié)機制，為同種異體MSCs產業(yè)化應用及最終走向臨床打下基礎。 實驗目的： (1)從人骨髓中分離培養(yǎng)hMSCs并在體外誘導成骨細胞，對其細胞生物學特性進行觀察； (2)應用流式、RT-PCR和WB研究hMSCs、DOC免疫原性及經IFN-γ處理后其免疫原性

5、的變化； (3)應用混合淋巴細胞反應(MLR)研究hMSCs、DOC及經IFN-γ，處理后在不同數(shù)量、不同刺激條件、不同天數(shù)下對外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響；應用ELISA研究hMSCs、DOC及經IFN-γ處理后細胞因子分泌情況，探討hMSCs免疫調節(jié)機制，從而了解以hMSCs為種子細胞構建的同種異體組織工程移植的可行性。 實驗方法： 1.人骨髓間充質干細胞生物學特性 (1)無菌條件下在志愿

6、者髂嵴處穿刺抽取20ml骨髓，經密度梯度離心分離純化hMSCs，培養(yǎng)在含15％胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)液里。 (2)比較hMSCs及DOC細胞生長曲線、細胞周期。 (3)FACS檢測第3代hMSCs、DOC(誘導后第6、12、18天)細胞的CD14、CD29、CD34，CD44、CD45、CD105，CD166表達。 (4)用四環(huán)素法、茜素紅法；Ⅰ型膠原、骨鈣素免疫組化染色鑒定DOC。 2.人骨髓間

7、充質干細胞免疫原性實驗研究 (1)以未分化的骨髓間充質干細胞(hMSCs)為對照，采用流式細胞技術分別檢測hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ等免疫相關分子的表達； (2)采用RT-PCR技術分別檢測hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的B7-H1、B7

8、-H4、HLA-B、HLA-DRA、HLA-DRB等免疫相關基因表達情況； (3)采用WB技術分別檢測hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第6、12、18天的DOC、DOC+IFN-γ的B7-H1、B7-H4等免疫相關因子表達情況； 3.人骨髓間充質干細胞免疫調節(jié)機制實驗研究 應用混合淋巴細胞反應(MLR)觀察： (1)不同數(shù)量級hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC、DOC+I

9、FN-γ，對經同種異體PBMCs刺激的PBMCs增殖的影響； (2)不同數(shù)量級hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對經有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖的影響； (3)不同天數(shù)hMSCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對經同種異體PBMCs和PHA刺激的PBMCs增殖的影響； (4)應用ELISA檢測hMSCs、hMSCs+IFN

10、-γ，和誘導后第18天的DOC、DOC+IFN-γ，其培養(yǎng)上清IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1和PGE2的表達情況。 實驗結果： 1.人骨髓間充質干細胞生物學特性 (1)細胞呈紡錘形或三角形，類似纖維細胞，旋渦樣排列；原代hMSCs接種后4d，可觀察到成纖維細胞樣的細胞集落，9至12d長滿單層培養(yǎng)瓶底，傳代細胞4至7d長滿單層；hMSCs及DOC細胞貼壁率無明顯差別，生長曲線hMSCs倍增

11、時間為38.1h，DOC為39.7h。hMSCs和DOC細胞周期比較，hMSCs細胞周期中S+G2比例較多，G1比例較少。表明：hMSCs生長增殖速度較DOC快。 (2)第3代細胞FACS檢測結果顯示：分離培養(yǎng)的細胞CD29、CD44、CD105、CD166表達強陽性，而CD14、CD34、CD45陰性。 (3)成骨誘導16d，四環(huán)素、茜素紅染色見到團塊狀細胞中有鈣鹽沉積；Ⅰ型膠原、骨鈣素免疫細胞化學檢測見到胞漿內有大量

12、的棕黃色顆粒。 2.人骨髓間充質干細胞免疫原性實驗研究 (1)FACS檢測結果顯示：與hMSCs組比較，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組HLA-Ⅰ表達上調(P＜0.05)，HLA-Ⅱ表達明顯上調(P＜0.01)。 (2)RT-PCR結果顯示：與hMSCs組比較，DOC組表達無統(tǒng)計學差異，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組B7-H1、B7-H4、HLA-B、HLA-DRA、HLA-DRB表

13、達明顯上調(P＜0.01)。 (3)WB結果顯示：與hMSCs組比較，DOC18天組、DOC+IFN-γ組B7-H1表達明顯上調(P＜0.01)；DOC12天組、hMSCs+IFN-γ組B7-H4表達上調(P＜0.05)；hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ，組B7-H4表達明顯上調(P＜0.01)。 3.人骨髓間充質干細胞免疫調節(jié)機制實驗研究 (1)應用混合淋巴細胞反應(MLR)觀察:①實驗組數(shù)量級hM

14、SCs、hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC、DOC+IFN-γ對經同種異體PBMCs刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細胞數(shù)量成正相關，其中105組與103組相比有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。②不同數(shù)量級hMSCs和誘導后第18天的DOC對經有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細胞數(shù)量成正相關。與陽性對照組相比，在103數(shù)量級，hMSCs+IFN-γ組、DOC+IFN-γ組對經有絲

15、分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖無抑制作用；hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC+IFN-γ對經有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，其抑制作用與細胞數(shù)量成正相關。③與陽性對照組相比，不同天數(shù)hMSCs和誘導后第18天的DOC對經同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，第6天抑制作用最強；與陽性對照組相比，在第4、6、8天，hMSCs+IFN-γ和誘導后第18天的DOC+I

16、FN-γ對經同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均有抑制作用，第8天抑制作用最強；在第2天，hMSCs+IFN-γ和DOC+IFN-γ對經同種異體PBMCs和有絲分裂原(PHA)刺激的PBMCs增殖均無抑制作用。 (2)應用ELISA檢測hMSCs、hMSCs+IFN-γ，和誘導后第18天的DOC、DOC+IFN-γ培養(yǎng)上清，均能分泌IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1和PGE2；與未

17、經IFN-γ刺激組相比，IFN-γ刺激組各細胞因子分泌水平均顯著增高(P＜0.01)。 結論： (1)采用密度梯度離心分離人骨髓獲得的細胞在形態(tài)、表面標志、多向分化能力方面都符合hMSCs的特征，在成骨誘導條件下可向成骨細胞分化，表達Ⅰ型膠原和骨鈣素，是骨組織工程較理想的種子細胞。 (2)體外實驗表明MSCs、DOC保持低免疫原性，在炎前細胞因子(IFN-γ)刺激下其免疫原性增強。 (3)hMSCs、hM