低免疫原性人胚胎干細(xì)胞系的建立.pdf

1、[目的]：
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)免疫豁免基因HLA-G、FasL遺傳修飾的人胚胎干細(xì)胞(hES)系。2.鑒定新構(gòu)建的、免疫豁免基因修飾人胚胎干細(xì)胞系的免疫學(xué)特性，為后期的研究工作奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]：
　　用Lenti-pac慢病毒包裝試劑盒包裝本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的、分別含HLA-G、FasL基因和帶新霉素、嘌呤霉素篩選標(biāo)志和熒光蛋白標(biāo)簽的質(zhì)粒，在293FT包裝細(xì)胞內(nèi)分別包裝成含不同目的基因的慢病毒，TCID50法測(cè)定病

2、毒滴度。根據(jù)病毒滴度推算合適病毒濃度轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定好的G418、puromycin對(duì)人胚胎干細(xì)胞的最低致死濃度，分別加入兩種抗生素篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞系。Trizol法分別提取篩選出的不同細(xì)胞的總RNA，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，Real Time PCR檢測(cè)HLA-G，F(xiàn)asL的mRNA表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，Westem blot方法檢測(cè)HLA-G、FasL的蛋白表達(dá)。分別將表達(dá)HLA-

3、G、FasL的人胚胎干細(xì)胞移植入昆明小鼠皮下，觀察移植細(xì)胞的存活、增殖和移植排斥情況。
　　[結(jié)果]：
　　1.包裝重組HLA-G、FasL慢病毒的和滴度測(cè)定。通過三質(zhì)粒體系在包裝細(xì)胞293FT進(jìn)行兩種慢病毒包裝，通過倍比稀釋法測(cè)得兩種慢病毒液滴度分別，為4.5×106、6.0×106TU/ml。HLA-G慢病毒載體含綠色熒光蛋白eGFP，F(xiàn)asL慢病毒載體含有紅色熒光蛋白mccherry。
　　2.建立穩(wěn)定表達(dá)HLA

4、-G、FasL的hES細(xì)胞系。采用已包裝成功的病毒感染hES細(xì)胞，分為感染HLA-G、FasL慢病毒的兩組細(xì)胞。72小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況，兩組均有熒光表達(dá)。第5天開始加入篩選藥物，HLA-G組加入濃度10μg/ml G418，F(xiàn)asL組加入濃度0.5μg/ml嘌呤霉素。連續(xù)篩選4周后熒光細(xì)胞比例明顯增高。
　　3.HLA-G+hES、FasL+hES細(xì)胞系的鑒定
　　3.1實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的外源

5、性HLA-G與FasL能在hES細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
　　3.2 western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HLA-G+hES細(xì)胞與FasL+hES細(xì)胞均有目標(biāo)蛋白條帶，提示外源性HLA-G與FasL能在hES細(xì)胞中表達(dá)。
　　4.HLA-G+、FasL+hES細(xì)胞系免疫原性檢測(cè)。將兩株細(xì)胞分為兩組，未轉(zhuǎn)入外源基因的hES細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，分別注射入三組昆明系小鼠腋下皮下，持續(xù)喂養(yǎng)、觀察，12周內(nèi)未見注射部位畸胎瘤形成，提示移植細(xì)胞受到免疫排