成骨分化的人臍血間充質干細胞免疫原性研究.pdf

1、目的:(1)通過觀察體外培養(yǎng)人臍血間充質干細胞(Umbilical cordblood-mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)并作誘導成骨分化，探討其作為組織工程的骨種子細胞的可行性。(2)通過建立混合淋巴細胞反應體系模擬成骨分化的UCB-MSCs移植入體內的免疫微環(huán)境條件，并觀察在不同免疫微環(huán)境條件下成骨分化的UCB-MSCs免疫相關膜蛋白的表達與可溶性細胞因子的分泌水平，研究成骨分化UCB-MSCs產生免疫

2、原性的相關機制。
　　方法:體外分離培養(yǎng)UCB-MSCs，流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達及其變化規(guī)律;體外成骨誘導人UCB-MSCs2周，采用Alizarin Red染色和鈣離子半定量測定的方法評價細胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs細胞，流式細胞儀檢測加入IFN-γ前后的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表達情況;流式細胞儀檢測UCB-MSCs在成骨誘導分化前后HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子的表達情況以觀

3、察成骨誘導分化的MSCs免疫抗原性的變化。體外分離外周血T淋巴細胞，成骨分化與未分化的UCB-MSCs分別與淋巴細胞共培養(yǎng)，模擬移植入宿主體內的未激活狀態(tài)的免疫微環(huán)境，3H-TdR摻入法檢測IFN-γ刺激前后的異體淋巴細胞增殖情況，以評測成骨分化前后的UCB-MSCs對異體淋巴細胞增殖的影響。建立隔離腔(Transwell)非接觸共培養(yǎng)混合淋巴細胞反應體系，評價成骨誘導分化前后的UCB-MSCs對淋巴細胞增殖反應的影響。ELISA定量檢

4、測培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的含量，觀察成骨誘導分化的UCB-MSCs對IFN-γ、IL-4分泌水平的影響。
　　結果:第1、3、5代細胞的CD29、CD105和CD166均呈陽性表達，而造血細胞系的表面標記CD31、CD34和CD45則呈低表達，且隨傳代次數增加含量逐漸下降。UCB-MSCs成骨誘導2周后，Alizarin Red染色為陽性。對照組則無明顯鈣鹽沉積。鈣離子半定量的檢測結果則表明，UCB-MSCs成骨誘導2周后

5、的鈣離子含量遠高于未誘導組。
　　流式細胞檢測結果顯示，人UCB-MSCs高表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子和CD40，CD80等共刺激分子;經IFN-γ刺激誘導后，HLA-Ⅰ類分子的表達未發(fā)生改變，HLA-Ⅱ類分子呈陽性表達，而CD40和CD80的表達仍為陰性。人UCB-MSCs在成骨誘導分化前后HLA-Ⅰ類分子均為陽性表達;而HLA-Ⅱ類分子在成骨分化前為陰性，誘導后陽性表達率增高。
　　UCB-MSCs單向

6、刺激淋巴細胞增殖反應的結果顯示，無論是否有HLA-Ⅱ類分子的表達（IFN-γ的刺激），UCB-MSCs對異體淋巴細胞增殖均有明顯的抑制效果，并且淋巴細胞的增殖在不同比例的共培養(yǎng)組之間也有顯著性差異。而成骨誘導分化的UCB-MSCs對淋巴細胞增殖的抑制作用明顯減弱（不隨細胞數量的改變而改變），并且在IFN-γ作用后，反而有刺激淋巴細胞增殖的效果。1×104及以上數量級的未誘導UCB-MSCs可以抑制PHA刺激的淋巴細胞增殖，但加入IL-2

7、后，這種抑制作用被逆轉。而成骨誘導分化的UCB-MSCs則不具有抑制淋巴細胞增殖的作用。
　　Transwell共培養(yǎng)實驗結果表明，與直接接觸培養(yǎng)相似，UCB-MSCs能夠顯著抑制淋巴細胞增殖反應，而成骨誘導分化的UCB-MSCs的免疫抑制能力明顯減弱。未誘導UCB-MSCs與淋巴細胞共培養(yǎng)7天，培養(yǎng)液上清中IFN-γ分泌水平下降，IL-4含量則顯著上調。而成骨分化的UCB-MSCs與淋巴細胞共培養(yǎng)7天后，IFN-γ分泌水平較對照