大黃素增強(qiáng)化療藥誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用的觀察.pdf

1、本文從不同的角度探討了天然蒽醌類(lèi)物質(zhì)大黃素增強(qiáng)化療藥5-氟尿嘧啶(5-Fu)誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的效應(yīng)及其可能機(jī)制。主要內(nèi)容包括： ①不同濃度大黃素(2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml)作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞2h，和以大黃素4μg/ml作用HepG2細(xì)胞不同時(shí)間(0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、16h及24h)，采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的動(dòng)態(tài)變化。

2、 ②不同濃度(2μg/ml、4μg/ml)大黃素單用或與化療藥5-Fu10mg/l聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞不同時(shí)間，以四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力的變化；FCM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布；透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 ③2μg/ml、4μg/ml大黃素單用或與10mg/l5-Fu聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞24h后，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Bcl-2、AIF蛋白表達(dá)

3、情況；利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)觀察各組細(xì)胞凋亡的改變；并對(duì)各組細(xì)胞凋亡率與Bax、Bcl-2及AIF蛋白表達(dá)作相關(guān)分析。 結(jié)果表明： HepG2細(xì)胞經(jīng)4μg/ml大黃素處理0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h后，其DCF的熒光值(代表細(xì)胞內(nèi)ROS的相對(duì)水平)分別為42.67±0.80(固有ROS水平)、61.71±1.35、66.64±1.4

4、4、73.74±1.67、88.87±1.81、84.58±1.37、63.34±1.84、53.91±1.50、44.86±1.84。15min時(shí)即可觀察到細(xì)胞內(nèi)ROS水平的大幅度升高，2h時(shí)升高到細(xì)胞固有ROS水平的2倍左右，2～4h基本穩(wěn)定在最高峰，之后逐漸降低，24h降至固有水平左右?？梢?jiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生在一定限度內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性。0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml大黃素孵育細(xì)胞2h后，DCF的熒光值分別為4

5、6.15±1.46、63.97±1.34、73.90±1.69、86.85±1.71，可見(jiàn)隨著大黃素濃度遞增，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生呈劑量依賴(lài)性地增加。 MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞在A組(僅含DMEM，對(duì)照組)、B組(10mg/l5-Fu)、C組(2μg/ml大黃素)、D組(4μg/ml大黃素)、E組(2μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)和F組(4μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)不同藥液作用了4h、8h、

6、16h和24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)與大黃素有良好的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。10mg/l5-Fu單用或者2μg/ml、4μg/ml大黃素單用均可引起活細(xì)胞的數(shù)目下降，大黃素與5-Fu聯(lián)用后更明顯地抑制了細(xì)胞活力，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比均有顯著降低(P＜0.05)，大黃素和5-Fu聯(lián)用組(E組、F組)與5-Fu單用組(B組)相比，存活率有極顯著降低(P＜0.01)，尤以24h時(shí)差異最顯著。 A～F組(以下分組同上述)不同藥液分別

7、孵育HepG2細(xì)胞16h、24h和48h，以FCM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。在細(xì)胞DNA直方圖上，16h時(shí)我們即可觀察到在DNA二倍體細(xì)胞G1峰前出現(xiàn)呈對(duì)稱(chēng)分布的“亞G1峰”，“亞G1峰”(亞二倍體峰)細(xì)胞所占檢測(cè)細(xì)胞百分比即是細(xì)胞凋亡指數(shù)(ApoptosisIndex，AI)或凋亡率。24h時(shí)B組(10mg/l5-Fu)、C組(2μg/ml大黃素)、D組(4μg/ml大黃素)、E組(2μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)和

8、F組(4μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)，細(xì)胞凋亡率分別為(7.25±1.10)％、(11.71±1.36)％、(12.98±1.67)％、(18.66±2.45)％、(27.27±2.63)％，可見(jiàn)隨著大黃素濃度遞增，各組凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，呈劑量依賴(lài)性。而48h時(shí)最大劑量大黃素與5-Fu聯(lián)用組(F組)細(xì)胞碎片明顯增多，細(xì)胞壞死增多，凋亡率降低為(24.56±2.23)％，說(shuō)明凋亡與繼發(fā)性壞死并存。大黃素與5-Fu聯(lián)合作用H

9、epG2細(xì)胞24h后細(xì)胞周期分析顯示，與對(duì)照組相比，聯(lián)用組(E組及F組)使G1期細(xì)胞比例增高，S期和G2期細(xì)胞比例降低，表明大黃素與5-Fu聯(lián)用可以誘導(dǎo)更多的腫瘤細(xì)胞凋亡并將其阻滯于G1期。 以A～F組不同藥液作用了24h的HepG2細(xì)胞，利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：A組(對(duì)照組)除極少數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有空泡外，絕大部分結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞體積較大，胞膜表面可見(jiàn)較多短的絨毛狀或指狀突起。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)清晰，

10、核圓形或不規(guī)則形，核質(zhì)比高，核仁明顯或有多個(gè)核仁，染色質(zhì)分布均勻，常染色質(zhì)為主。B、C、D組，除可見(jiàn)形態(tài)完整的肝癌細(xì)胞外，有一定數(shù)量的凋亡細(xì)胞散在分布。E、F組，即大黃素與5-Fu聯(lián)用組，凋亡細(xì)胞明顯增多，尤以F組顯著。結(jié)構(gòu)較為完整的癌細(xì)胞僅占少數(shù)，大部分細(xì)胞處于凋亡的不同階段。凋亡早期細(xì)胞：細(xì)胞輕微皺縮，胞膜表面突起減少。胞質(zhì)電子密度略高。核輕微固縮，染色質(zhì)邊集；凋亡中期細(xì)胞：細(xì)胞體積變小，胞膜表面突起消失。胞質(zhì)電子密度高。染色質(zhì)進(jìn)一

11、步邊集，有的濃縮成較大的團(tuán)塊，或呈圓形、半圓形邊集于核膜下；凋亡晚期細(xì)胞：核固縮成團(tuán)，形成凋亡小體。F組除凋亡細(xì)胞外，還可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)生壞死：此種細(xì)胞明顯腫脹，胞膜缺損，胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)空泡，核腫脹，染色質(zhì)溶解。在E、F組中有些細(xì)胞核呈現(xiàn)凋亡樣改變，而胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹，形成大小不等的空泡，但胞膜完整，即所謂不典型凋亡改變。 為了證實(shí)大黃素通過(guò)提升肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平來(lái)增強(qiáng)化療藥5-Fu促細(xì)胞凋亡作用的推論，我們進(jìn)一步采用免

12、疫組織化學(xué)法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)了HepG2細(xì)胞在各組藥液作用24h后凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Bcl-2及AIF蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Bax蛋白表達(dá)顯色各實(shí)驗(yàn)組(5-Fu單用組除外)較對(duì)照組均明顯加深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均明顯增多，大黃素與5-Fu聯(lián)用組(E組、F組)更甚，并且D組(4μg/ml大黃素)與C組(2μg/ml大黃素)相比、F組(4μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)與E組(2μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)相比，Ba

13、x蛋白表達(dá)前者較后者均有極顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，說(shuō)明Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)度與大黃素呈明顯的劑量依賴(lài)性。 HepG2細(xì)胞在各組藥液作用24h后Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯色均明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，D組(4μg/ml大黃素)與C組(2μg/ml大黃素)相比、F組(4μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)與E組(2μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)相比，Bcl-2蛋白

14、表達(dá)前者較后者均有極顯著減弱(P＜0.01)。大黃素與5-Fu聯(lián)用組(E組、F組)Bcl-2蛋白表達(dá)比5-Fu單用組(B組)明顯減少，并與大黃素有顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系。 HepG2細(xì)胞在各組藥液作用24h后AIF蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組AIF蛋白表達(dá)顯色較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)，差異均有顯著性意義(P＜0.05)。D組(4μg/ml大黃素)與C組(2μg/ml大黃素)相比、F組(4μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)與E組(

15、2μg/ml大黃素+10mg/l5-Fu)相比，AIF蛋白表達(dá)前者較后者均有極顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。同時(shí)，大黃素與5-Fu聯(lián)用組(E組、F組)AIF蛋白表達(dá)比5-Fu單用組(B組)明顯增強(qiáng)，且與大黃素呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。 采用TUNEL技術(shù)檢測(cè)用A～F組不同藥液作用了24h的HepG2細(xì)胞的凋亡改變。結(jié)果表明，從A組至F組，凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，各組平均凋亡率依次為3％、10％、14％、18％、21％和31％。F組(4μg

16、/ml大黃素+10mg/l5-Fu)凋亡細(xì)胞最多，同時(shí)可見(jiàn)壞死細(xì)胞的存在。并且HepG2細(xì)胞凋亡率與大黃素有劑量依賴(lài)關(guān)系，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，該結(jié)果與FCM檢測(cè)結(jié)果基本一致。 同時(shí)，我們對(duì)A～F組不同藥液作用了24h的細(xì)胞的凋亡率與本文涉及到的三種凋亡相關(guān)蛋白，即Bax、Bcl-2及AIF蛋白表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，A～F組不同藥液孵育細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞凋亡率與Bax蛋白表達(dá)呈顯著正相

17、關(guān)(r=0.881，P＜0.05)；與Bcl-2蛋白表達(dá)呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.942，P＜0.01)：與AIF蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.900，P＜0.05)。 綜上所述，我們認(rèn)為，大黃素可劑量和時(shí)間依賴(lài)性地提升肝癌HepG2細(xì)胞的ROS水平，4μg/ml大黃素作用2h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到最高峰。不同濃度大黃素與5-Fu聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞，可時(shí)間及劑量依賴(lài)性地增強(qiáng)5-Fu對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用。聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率及B