HBX在TRAIL誘導肝癌細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：探討乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene，HBX)促TRAIL誘導肝癌細胞凋亡作用及其機制，為揭示HBX的致病機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：(1)克隆人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)基因片段并克隆入原核表達載體pET30a(+)，構建重組質粒pET30a(+)/TRAIL，

2、經(jīng)測序正確后，將重組質粒轉入大腸桿菌進行表達，優(yōu)化蛋白表達條件，提取并純化His-TRAIL蛋白，鑒定其生物學活性。(2)培養(yǎng)Huh7、Huh7-3.1、Huh7-HBX細胞，將3000ng/ml His-TRAIL作用于各組細胞48h后，采用CCK8、流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡情況;免疫熒光、Western blot檢測細胞死亡受體DR4和DR5表達的變化;分光亮度法檢測細胞caspase8、caspase3活性的變化。(3)收集臨

3、床病人肝癌標本（HBV陽性及HBV陰性），免疫組織化學檢測HBX、DR4和DR5的表達，觀察HBX對DR4、DR5表達的影響。
　　結果：(1)成功構建重組質粒pET30a(+)/TRAIL，誘導表達后收集的TRAIL蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、Western blot結果顯示為可溶性的His-TRAIL，鎳離子親和層析柱分離純化獲得目的蛋白。CCK8結果顯示His-TRAIL蛋白對肝癌細胞具有促凋亡作用而對正常肝細胞無細胞毒

4、作用。(2) CCK8結果顯示，Huh7-HBX組的細胞增殖情況與Huh7-3.1組和Huh7細胞相比均顯著降低(P＜0.05）;流式細胞術檢測結果顯示，Huh7-HBX組的細胞凋亡率較Huh7-3.1和Huh7組細胞均顯著提高(P＜0.05）;免疫熒光、Western blot證實HBx蛋白能夠提高Huh7細胞死亡受體(death receptor) DR4、DR5的表達量;caspase活性檢測結果顯示，在His-TRAIL的作用下

5、，HBX能顯著提高Huh7細胞caspase8、caspase3的活性（P＜0.05）。(3)臨床肝癌標本免疫組織化學顯示HBV感染的病人有HBx的表達，并且在有HBx表達的肝癌組織中DR4、DR5的表達有所增加。
　　結論：(1)成功構建表達可溶性、具有生物學活性的TRAIL蛋白原核表達載體pET30a(+)/TRAIL。(2) HBX能夠促進TRAIL誘導Huh7細胞的凋亡，其機制可能與上調細胞DR4、DR5的表達從而激活死亡