Ras信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及FBW7、cyclin E表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 研究Ras及其下游PI3K和MAPK信號(hào)通路對(duì)人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期素E（cyclin E）表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討介導(dǎo)cyclin E泛素化降解的抑癌蛋白F-盒和含蛋白7的WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域（FBW7）在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，并觀察調(diào)控cyclin E表達(dá)的Ras下游信號(hào)通路對(duì)FBW7表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.以宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察Ra

2、s信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布及cyclin E表達(dá)的影響：不同濃度Ras信號(hào)通路阻斷劑FTI-277處理HeLa細(xì)胞，噻唑蘭比色（MTT）法檢測(cè)FTI-277對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)FTI-277對(duì)HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響；RT-PCR和Western blot檢測(cè)FTI-277對(duì)HeLa細(xì)胞cyclin E的mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。
　　 2.觀察Ras下游PI3K和MAP

3、K信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及cyclinE表達(dá)的影響：不同濃度PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY-294002和MAPK信號(hào)通路阻斷劑UO-126分別處理HeLa細(xì)胞，MTT法分別檢測(cè)兩者對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制率；RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)兩者對(duì)HeLa細(xì)胞cyclin E的mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。
　　 3.觀察Ras下游調(diào)控cyclin E表達(dá)的MAPK信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞FBW7表達(dá)的影響：RT-P

4、CR和Western blot檢測(cè)UO-126對(duì)HeLa細(xì)胞FBW7的mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響；免疫熒光法觀察HeLa細(xì)胞FBW7的分布及UO-126對(duì)HeLa細(xì)胞FBW7表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT實(shí)驗(yàn)顯示，Ras信號(hào)通路阻斷劑FTI-277具有抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用，且具有時(shí)效量效依賴(lài)性。結(jié)果顯示10μmol/L的FTI-277藥物濃度處理組線(xiàn)性相關(guān)性最好，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們采用10μm

5、ol/L的FTI-277作為干擾因素，探討FTI-277對(duì)HeLa細(xì)胞周期及cyclin E表達(dá)的影響。FCM檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，F(xiàn)TI-277作用后細(xì)胞周期滯留于G1/S期，且具有時(shí)間依賴(lài)性。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示FTI-277作用后，HeLa細(xì)胞cyclin E mRNA水平無(wú)明顯改變，cyclin E蛋白表達(dá)水平減弱。
　　 2.PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY-294002和MAPK信號(hào)通路阻斷劑U

6、O-126均顯示出抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用，10μmol/L的LY-294002藥物濃度處理組和10μmol/L的UO-126藥物濃度處理組分別顯示出最好的線(xiàn)性相關(guān)性，因此，實(shí)驗(yàn)中采用10μmol/L的LY-294002和10μmol/L的UO-126處理HeLa細(xì)胞，觀察不同時(shí)間梯度下cyclin E表達(dá)的變化。LY-294002對(duì)cyclin E的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，相對(duì)之下，UO-126能下調(diào)cyclin E的蛋白表達(dá)。

7、　　 3.RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示UO-126作用后，HeLa細(xì)胞FBW7 mRNA及蛋白表達(dá)均增多。免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)BW7在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有表達(dá)，細(xì)胞核部位表達(dá)較多。UO-126處理HeLa細(xì)胞后FBW7陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，并具有時(shí)間依賴(lài)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.HeLa細(xì)胞的異常增殖與Ras信號(hào)通路的激活有關(guān)，阻斷Ras信號(hào)通路激活可以減慢HeLa細(xì)胞周期G1/s期的進(jìn)程