重組人核糖核酸酶抑制因子對(duì)小鼠腦缺血的抗氧化保護(hù)作用及其抗腫瘤的研究.pdf

1、背景介紹：核糖核酸酶抑制因子<'[1](Ribonudease Inhibitor，RI)是分布在胞漿內(nèi)酸性糖蛋白，分子量約為50KDa<'[2]，其基因位于染色體11p15.5，三級(jí)結(jié)構(gòu)呈對(duì)稱的馬蹄型。RI包含15個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat，LRP)<'[3]>，而且每個(gè)R1分子中含有32個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，其中至少30個(gè)半胱氨酸的巰基以還原型巰基的形式存在，還原型巰基是保持RI正常生物學(xué)活性所必需

2、的，這也決定了R1只有在還原性的環(huán)境中才能發(fā)揮其作用。RI是核糖核酸酶A(Ribonuclease A，RNase A)的抑制劑，可以有效地抑制其對(duì)RNA的水解作用。RNaseA與血管生成因子(Angiogenin，Ang)的氨基酸有著高度保守的同源順序。Ang是由腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的分子量為14.4kDa的蛋白質(zhì)，屬于RNaseA超家族的一員，在組織和細(xì)胞中的分布十分廣泛。血管生成因子在體內(nèi)和體外均具有強(qiáng)烈的誘發(fā)血管生成的活性。R

3、I通過(guò)與RNaseA(ki=4.0x10<'-14>M)的緊密結(jié)合而抑制他們的活性<'[4]>。根據(jù)cDNA序列分析，Ang與RNase A有35﹪的同源性；但Ang與RI有更大的親和力(ki=7.1×10<'-16>M)。X射線分析表明，Ang與RNaseA有著極其相似的立體結(jié)構(gòu)，二者都可以與人胎盤(pán)RI緊密結(jié)合。由于RI可以與Ang形成緊密的非共價(jià)結(jié)合，從而可以抑制其促血管生成的活性。此外RI還可能通過(guò)抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-

4、FGF)的表達(dá)等途徑抑制血管生成。 目的： 1.通過(guò)腦缺血再灌注損傷模型的建立，觀察RI對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷的影響。 2.通過(guò)RI對(duì)黑色素瘤小鼠的腫瘤抑制作用來(lái)進(jìn)一步闡明RI對(duì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)方面的影響。 方法： 1.重組的pGEX-6p-1-hri大腸桿菌中表達(dá)和純化將重組的pGEX-6p-1-hri轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta表達(dá)菌中，在0.5mmol的誘導(dǎo)劑IPTG和16℃的溫度條件下

5、來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)目的融合蛋白，收集大量培養(yǎng)的菌體，經(jīng)超聲破碎，收集離心后的上清，經(jīng)由 GST 親和層析柱分離純化，及20﹪聚乙二醇8000濃縮。 2．RI對(duì)小鼠腦缺血再灌注的影響將純化后的GST-RI腹腔注射到小鼠體內(nèi)，預(yù)先保護(hù)3天后，手術(shù)分離出頸總動(dòng)脈，結(jié)扎、制作腦缺血損傷模型<'[6]>。組別為：假手術(shù)組，模型組，GST-RI低劑量治療組，GST-RI中劑量治療組，GST-RI高劑量治療組，GST 治療組，術(shù)后缺血再灌注30min后，第2

6、次給藥(同術(shù)前)，小鼠腦缺血24h后斷頭處死，檢測(cè)SOD、MDA、GSH-Px指標(biāo)，并在光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度。 3．RI對(duì)黑色素瘤小鼠的腫瘤抑制將小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16接種在小鼠皮下，分別以生理鹽水為陰性對(duì)照，以環(huán)磷酰胺為陽(yáng)性對(duì)照，高低劑量的融合蛋白進(jìn)行治療。觀察GST-RI是否可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)果： 融合蛋白GST-RI能顯著降低腦缺血小鼠皮質(zhì)及海馬組織中MDA的含量，能顯著提高腦缺血小鼠

7、腦皮質(zhì)及海馬組織中SOD、GSH-PX的活力。皮下注射GST-RI，對(duì)小鼠黑色素瘤的抑制作用與劑量有線性關(guān)系。當(dāng)劑量為5000U(0.52mg/kg)時(shí)抑制率最高可達(dá)34.62﹪，當(dāng)劑量增加到10000U(1.04mg/kg)時(shí)抑制率最高可達(dá)46.33﹪，平均抑瘤率為40.50﹪。說(shuō)明GST-RI可以通過(guò)抑制腫瘤血管生成的途徑抑制腫瘤的生長(zhǎng)，瘤重減輕。 結(jié)論： 融合蛋白GST-RI對(duì)腦缺血小鼠腦組織有很強(qiáng)的抗氧化作用，對(duì)