人核糖核酸酶抑制因子對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ的影響及其機(jī)理的研究.pdf

1、核糖核酸酶抑制因子(RibonucleaseInhibitor，RI)是一種胞漿內(nèi)酸性蛋白質(zhì)，分子量約為50KDa。RI是核糖核酸酶A(RibonucleaseA，RNaseA)的抑制劑，可以有效地抑制其對(duì)RNA的水解作用。RI也是血管生成因子(Angiogenin，Ang)的高效抑制劑。血管生成因子具有強(qiáng)烈的促進(jìn)新生血管形成活性，而腫瘤生長(zhǎng)與新生血管密切相關(guān)，因此Ang的存在有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。RI與Ang結(jié)合后可以抑制Ang的促血

2、管生成活性，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。RI由含有許多亮氨酸重復(fù)順序的多肽組成，含有這樣重復(fù)順序的一百多種蛋白質(zhì)顯示了廣泛的功能，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以及抑制酶活性等。RI定位于染色體的11p15.5，同樣位于此位置的胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-2)是促有絲分裂原，它不僅是通過(guò)旁分泌與自分泌形式調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和轉(zhuǎn)化的多肽，而且是信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的刺激因子。上述各種過(guò)程的失衡促使細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而導(dǎo)致惡變。

3、有證據(jù)證明IGF-2在許多腫瘤細(xì)胞中可使細(xì)胞增殖增加，抑制凋亡，增加局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。另外有研究[27]觀察到IGF-2可以直接促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生成Angiogenic(血管生成素)，從而促進(jìn)新生血管的形成。RI與IGF-2位于人染色體同一位置附近，而具有截然相反的生理作用。故而，推測(cè)二者可能存在某種相互作用關(guān)系，并進(jìn)一步探討研究RI在信號(hào)傳導(dǎo)中的重要生理作用，從而為RI的抗腫瘤，抗血管生成作用提供重要的理論依據(jù)。 本研究的目

4、的在于探討真核細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RI對(duì)IGF-2的影響，并進(jìn)一步了解二者相互作用關(guān)系，以其闡明RI抗腫瘤、抗氧化的作用機(jī)理。本試驗(yàn)將人核糖核酸酶抑制因子(hRI)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pLNCX-RI)經(jīng)過(guò)病毒包裝細(xì)胞(PA317)包裝后的高滴度病毒上清，感染真核細(xì)胞：人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞系，經(jīng)G418篩選后，使hRI在MCF-7中高表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)其對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-2)的影響，并研究二者可能存在的相互作用關(guān)系及其作用機(jī)理。本

5、論文的主要工作如下： 1.將人核糖核酸酶抑制因子基因的cDNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系PA317包裝后，轉(zhuǎn)染到MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中，用轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)RT-PCR、蛋白免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，獲得穩(wěn)定高表達(dá)人核糖核酸酶抑制因子的MCF-7細(xì)胞株。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染RI組RT-PCR檢測(cè)到pLNCX-RI的表達(dá)，且免疫蛋白印跡顯示hRI蛋白表達(dá)增強(qiáng)。 2.通過(guò)RT-

6、CPR、WesternBlotting、免疫細(xì)胞化學(xué)以及細(xì)胞免疫熒光，檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-2)在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的變化，以此分析人核糖核酸酶抑制因子對(duì)其影響。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組IGF-2基因在mRNA水平?jīng)]有明顯變化，而在蛋白水平和對(duì)照組比較表達(dá)量升高，且免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光顯示不同組間差異顯著。 3.運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)，研究二者可能存在的直接或間接相互作用關(guān)系。在SDS-PAGE電

7、泳得到相互作用的幾種蛋白，并通過(guò)WesternBlotting驗(yàn)證二者存在直接或間接相互作用關(guān)系。 試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞中，穩(wěn)定高表達(dá)的人核糖核酸酶抑制因子在mRNA水平上不能引起胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-2的變化，而在蛋白水平使其表達(dá)量升高，并通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)到二者的確存在直接或間接的相互作用關(guān)系。 上述結(jié)果提示RI可能通過(guò)與胞漿內(nèi)的IGF-2結(jié)合，引起IGF-2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

8、量相對(duì)升高，從而阻斷其與IGF受體的結(jié)合，達(dá)到抑制某一信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制其促腫瘤細(xì)胞增殖的功能。這些發(fā)現(xiàn)提示RI可能在某些組織中具有抑癌基因的功能，RI可能成為基因治療的靶基因。今后的研究可以進(jìn)一步深入研究探討RI究竟是通過(guò)哪一條信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)達(dá)到抗腫瘤、抗氧化的功能，并可通過(guò)基因敲除和RNA干涉技術(shù)，來(lái)確定RI基因的表達(dá)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解RI的生物學(xué)功能及其抗腫瘤的確切的分子機(jī)制，并為RI的臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依