茶樹冷脅迫誘導(dǎo)抗寒相關(guān)基因的分離與表達(dá)分析.pdf

1、茶樹（Camellia sinensis）是我國的一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，茶樹原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜暖喜濕的葉用植物，茶樹抗寒力弱，不易抵御寒害。隨著人們對(duì)茶葉需求量的增加，茶樹種植范圍的不斷擴(kuò)大，茶樹種植區(qū)域逐漸北移；同時(shí)，隨著近幾年全球氣溫變化的不穩(wěn)定性，預(yù)防氣溫特別是低溫給茶樹生長可能造成的傷害，也愈來愈顯示出其重要性。怎樣提高茶樹的抗寒性，已日益引起人們的高度重視。茶樹抗寒力具有潛在的遺傳特性，冷馴化能誘導(dǎo)這種潛能的表達(dá)并發(fā)揮

2、茶樹的最大抗寒力。茶樹在冷馴化過程中，不僅體內(nèi)生理和生化過程發(fā)生變化，而且許多受低溫調(diào)節(jié)的特異蛋白和mRNAs也被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 本研究利用cDNA-AFLP的方法進(jìn)行龍井43品種茶樹人工冷脅迫誘導(dǎo)的基因差異顯示的方法，獲得冷誘導(dǎo)條件下基因表達(dá)的差異片段，對(duì)這些片段進(jìn)行分析，克隆獲得與茶樹抗寒相關(guān)的基因，并對(duì)這些基因的序列、物種同源性以及相關(guān)功能進(jìn)行初步分析，以求弄清茶樹抗寒的調(diào)控機(jī)制。主要研究成果如下：
　　 (1)

3、利用cDNA-AFLP技術(shù)構(gòu)建了茶樹在低溫脅迫下基因差異表達(dá)圖譜。用16對(duì)引物（256個(gè)組合）對(duì)三個(gè)樣品池進(jìn)行了差異條帶的篩選，結(jié)果表明在冷脅迫不同處理時(shí)期相關(guān)基因表達(dá)存在明顯差異。選擇性回收了10條差異表達(dá)cDNA片段，克隆測序，BLAST序列同源性檢索顯示其中片段1與一種低溫和鹽脅迫響應(yīng)蛋白有77％的同源性；片段5與擬南芥冷誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)60s ribosomal protein L7(RPL7B)有89％的同源性；片段8與一種逆境誘

4、導(dǎo)的蛋白（Stress-induced H1-Histone protein）具有79％的相似性；片段9與干旱條件下的EST序列有著較高的同源性；片段10與擬南芥等中的CBF基因有較高的同源性；其它片段在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到相似序列，可能為新基因。
　　 (2)前期獲得一低溫誘導(dǎo)后特異表達(dá)的差異片段，TDF10( transcript derived fragment,TDF)，經(jīng)BLAST比對(duì)，該片段與其它物種的Str

5、ess-induced Hl-Histone protein基因有很高的同源性。假陽性驗(yàn)證之后，通過3’/5'RACE的方法分別擴(kuò)增出其3’和5’末端序列，從而成功獲得該基因cDNA全長序列（GenBank，登錄號(hào)EU716314）。所得序列全長916bp,編碼207氨基酸，分子量約為30.77 KDa。該基因氨基酸序列經(jīng)BLAST分析表明，其與煙草的Stress-induced Hl-Histone protein基因的氨基酸序列同源

6、性79％。
　　 (3)前期獲得低溫誘導(dǎo)后特異表達(dá)的差異片段TDF10(transcript derived fragment, TDF)。經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)該片段與白菜、擬南芥、煙草的抗寒基因CBF( C-repeat binding factor）分別有94％、84％、81％的同源性。通過3’/5'RACE的方法獲得該片段cDNA全長序列（GenBank，登錄號(hào)EU857638）。所得序列全長981bp，其開放閱讀框編碼2