茶樹花蕾發(fā)育差異表達基因克隆與分析.pdf

1、茶樹是我國的一種重要的經(jīng)濟作物，是常綠葉用異花授粉植物。在種植上，為了收獲鮮葉，茶樹的樹叢的高度一般保持在10-100厘米，這個過程一般可以持續(xù)上百年，茶樹鮮葉的產(chǎn)量直接影響到該產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。茶樹種植一般3-5年后每年都要開花結(jié)實，直到植株死亡每年進行。在自然授粉條件下，大多數(shù)茶樹的開花率都比較高，可是結(jié)實率品種之間卻有很大的區(qū)別。茶樹從花芽形成到種子成熟，共經(jīng)過約一年半左右的時間，而且從6月到12月的6個月時間中，一方面是當年的茶花

2、孕蕾開花和授粉，另一方面是上一年受精的茶花發(fā)育形成種子并成熟的過程，兩年的花果同時發(fā)育生長，都是大量消耗養(yǎng)分的生理和生長活動過程。花果的生長和發(fā)育對茶樹養(yǎng)分的供應的要求很高，往往會抑制營養(yǎng)生長，新梢不能發(fā)育，導致茶樹鮮葉產(chǎn)量減少。因此，怎么有效地控制茶樹生殖生長，加強茶樹的營養(yǎng)生長成為茶樹育種的一個關鍵問題。 由于茶樹是多年生異花授粉的木本植物，品種選育和基礎遺傳研究難度大。早在二十世紀初，就有茶樹育種專家想通過自交的方式獲得茶

3、樹的純種，但是沒有成功。所以目前在茶葉生產(chǎn)上茶樹的繁殖推廣多采用短穗扦插的無性繁殖方式進行，有利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳。茶葉生產(chǎn)上不提倡用種子繁殖，主要是有性繁殖的后代出現(xiàn)性狀分離現(xiàn)象，因而不能象其他作物那樣利用基因型相同的雜種一代。近年來有關茶樹品質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物的研究進展較快，但是有關茶樹生殖生物學的研究進行得還不是很多。 茶樹的開花，是一個連續(xù)的過程，它意味著不同的發(fā)育階段，包括花芽分化、始花、成花、盛花期都有可能在同一棵植

4、株上同時發(fā)生。所有這些過程都是連續(xù)不間斷的，所以很難被獨立的分析。目前，有關茶樹代謝組學功能基因研究進展較快，但是對茶樹的發(fā)育的研究進行得非常少。至于茶樹花發(fā)育性狀分子生物學方面的研究，國內(nèi)外還沒有報道。 本研究以茶樹結(jié)實率差異顯著的兩個品種龍井43和烏龍為材料，利用cDNA-AFLP技術，從分子水平上，對茶樹花蕾發(fā)育過程中基因表達的時空特異性進行了研究，試圖通過分離茶樹花發(fā)育相關基因，獲得某些與茶樹生殖發(fā)育機理得相關線索，從分

5、子生物學水平上研究茶樹發(fā)育性狀。通過研究取得了如下結(jié)果： (1)對cDNA-AFLP技術體系進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：cDNA-AFLP預擴增適宜退火溫度為53℃，擴增循環(huán)次數(shù)為20個循環(huán)，預擴增和選擇性擴增PCR體系中Mg2+濃度均為2.3mM。對茶樹兩個品種的不同發(fā)育階段的花蕾進行共64對引物組合的cDNA-AFLP分析，高結(jié)實率和低結(jié)實率兩個品種的花蕾之間表達存在差異，同一品種花蕾發(fā)育不同時期基因表達存在差異。 (2)

6、利用E11M11引物對茶樹兩個品種花蕾發(fā)育不同時期表達差異進行cDNA-AFLP分析，在兩個品種的大花蕾中同時發(fā)現(xiàn)一條特異表達條帶(ChaH-1)。RT-PCR證明該基因只在茶樹兩個品種的大花蕾中特異表達。利用RACE技術得到該基因cDNA全長，全長為1537bp，命名為Tua1。經(jīng)BLAST查詢對比，該基因堿基序列與擬南芥中的α-微管蛋白基因有87％的相似性。Tua1的ORF從第6號堿基開始，第1535號堿基終止，1350個堿基編碼4

7、50個氨基酸。 (3)通過RT-PCR法擴增出Tua1基因cDNA編碼區(qū)全序列，并將其克隆到表達()體pET-32a(+)中，在表達宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表達，產(chǎn)生分子量約為69kDa的融合蛋白，該融合蛋白包括112個氨基酸殘基的硫氧還原蛋白及450個氨基酸殘基的Tua1蛋白。隨著誘導時間的延長，表達的融合蛋白產(chǎn)量逐漸增加，表達蛋白總量最高可達到菌體總蛋白的34.24％；在菌體的各個部位中，融合蛋白主要在細胞質(zhì)中