‘富士’蘋果紅色芽變果實(shí)金屬硫蛋白基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、MolecularCloningandExpressionAnalysisofTwoMetallothioneinGenesin‘Fuji，AppleanditsRedMutant(MalusdomesticaBorkhCVFuji)ThesissubmittedtoQngdaoAgriculturalUniversityInFulfi1ImentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronom

2、y，一一ZhongZhaodi(DepartmentofHorticulture)Supervisor：YuanYongbingQingdaoChinaJune，2013青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要‘富士’蘋果紅色芽變果實(shí)金屬硫蛋白基因的克隆與表達(dá)分析摘要金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類能夠結(jié)合重金屬的富含半胱氨酸(Cys)低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物界，目前已從多種生物中克隆到了金屬硫蛋白基因，很多研究表明，

3、金屬硫蛋白的表達(dá)在不同的組織和不同的生長發(fā)育時(shí)期存在著明顯的基因差異，而且其在植物生長中的作用目前不是十分明確。本研究從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的‘富士’蘋果紅色芽變果實(shí)的SSH文庫中克隆出兩個(gè)金屬硫蛋白基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)這兩個(gè)金屬硫蛋白基因在不同部位和不同時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，構(gòu)建了原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，為以后蘋果金屬硫蛋白的獲得和研究奠定了基礎(chǔ)，此外還構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體和植物亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，以方便進(jìn)一步研

4、究蘋果金屬硫蛋白基因在植物生長發(fā)育過程中的作用和金屬硫蛋白基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)部位。1蘋果金屬硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的克隆本文根據(jù)從構(gòu)建好的SSH文庫中獲得的ESTq歹】為模板，設(shè)計(jì)引物，利用RACEPCR技術(shù)，獲得兩個(gè)金屬硫蛋白基因的cDNA全長，分別將其命名為MdMT2和MdMT3。^锨^仍的全長為639bp，基因內(nèi)部包括一個(gè)長度為240bp可編碼79個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)，^織^仃；的全長為495bp，基因

5、內(nèi)部包括一個(gè)長度為201bpff綁566個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)。2MdMT2、MdMT3基因編碼的蛋白的生物學(xué)分析利用相關(guān)生物分析軟件和程序分析基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和性質(zhì)，MdMT2蛋白預(yù)測(cè)的蛋白分子量為77938Da，等電點(diǎn)為475，分子式為C297H483N910114S20，且MdMT2具有一個(gè)Metallothio2superfamily結(jié)構(gòu)功能域，跨膜預(yù)測(cè)分析MdMT2蛋白是膜間蛋白。MdMT3預(yù)測(cè)的蛋白分子量為6

6、9297Da，等電點(diǎn)為478，分子式為C275‰2N820103S12，跨膜預(yù)測(cè)分析^紀(jì)^仍蛋白為膜內(nèi)蛋白。3Real—timePCR分析MdMT2、MdMT3基因的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR：JL術(shù)，分別分析了MdMT2、MdMT3基因在蘋果果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的果皮中的表達(dá)差異和在葉片、花、莖，果皮、果肉五個(gè)不同器官部位中的表達(dá)差異，結(jié)果表明MdMT2在芽變富士和普通富士中的表達(dá)趨勢(shì)一致，都是在成熟果皮中的相對(duì)表達(dá)量最高，但在芽變富士中