蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)姓名：鄧小亮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：李冰20100601廣州醫(yī)學(xué)院碩士論文蟹多拷貝串聯(lián)重組金屬硫蛋白基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)3材料與方法材料與方法1、pET1MT、pET2MT、pET3MT重組多拷貝重復(fù)表達(dá)MT原核載體的和基因工程菌的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)：由于要插入多個(gè)拷貝數(shù)的目的基因，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要考慮插入片段的順序問題，

2、既逐個(gè)片段插入。在設(shè)計(jì)第1對(duì)引物的時(shí)候，除在上游引物上添加一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)外，于下游引物上添加2個(gè)了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，專為下一個(gè)片段的插入提供條件。類似的第2對(duì)引物的下游引物上也添加了特異性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，專為第3個(gè)片段插入提供條件。在每條下游引物5’端添加一個(gè)特異性的蛋白切割位點(diǎn)，以滿足實(shí)驗(yàn)或有的要求能將多串聯(lián)拷貝數(shù)的目標(biāo)蛋白切割成單體。2)常規(guī)PCR：分別以3對(duì)引物和本中心原有的重組質(zhì)粒GSTMT為模板，通過常規(guī)PCR獲得MT基因

3、的CDS片段3份，各份片段之間的區(qū)別僅在于片段兩端所帶的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)不完全相同。按照插入順序的要求，分別標(biāo)記為第1、2、3目的片段3)TA克?。簩CR擴(kuò)增的3個(gè)片段分別與pMD19TSimpleVect做TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選陽性克隆，雙酶切、測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示正確后將重組T載體依據(jù)所含的目的片段在預(yù)先設(shè)計(jì)時(shí)插入的順序，標(biāo)記為T1、T2、T3。4)亞克隆：選用原核表達(dá)載體pET15b，建立融合6個(gè)His標(biāo)簽的金屬硫蛋

4、白基因多串聯(lián)重復(fù)表達(dá)載體。用選定的第1組限制性內(nèi)切酶特異性切割T1和原核表達(dá)載體pET15b，膠回收目的片段，將帶限制性內(nèi)切酶粘性末端的第1目的片段通過T4DNA聯(lián)接酶聯(lián)接到原核表達(dá)載體pET15b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，挑選陽性克隆雙酶切、測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示完整地插入了目的基因片段后，標(biāo)記為pET1MT。類似地以第2組限制性內(nèi)切酶切割T2和pET1MT載體，膠回收目的片段，將帶限制性內(nèi)切酶粘性末端的第2目的片段插