PICK1基因敲除對炎性疼痛的作用及相關機制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：PICK1基因敲除對炎性痛覺行為學的影響
　　 目的：PICK1(蛋白激酶Cα相互作用蛋白1，protein interacting with Cαkinase 1)是從線蟲到人的所有生物中非常保守的一類存在于細胞質(zhì)中的膜結合蛋白，自1995年被發(fā)現(xiàn)以來，已報道能與20多種蛋白發(fā)生相互作用。PICK1在人和動物的組織和細胞內(nèi)均可表達，廣泛分布于機體的各種組織。PICK1參與一些疾病的發(fā)

2、生，如：癌癥、精神分裂癥、疼痛、帕金森綜合癥等。雖然PICK1在這些疾病發(fā)生過程中的具體作用機制現(xiàn)在還不清楚，但其廣泛的結合特性使其可能通過與疾病相關蛋白的相互作用進而在疾病發(fā)生過程中扮演一定角色。
　　 炎癥是一種常見的病理情況，在組織炎癥時，病變部位可產(chǎn)生慢性持續(xù)性疼痛和痛覺過敏，不僅使患者感到不適或痛苦，并且可造成諸多生理功能障礙和精神疾病，如睡眠失調(diào)、抑郁癥、注意力下降等。已有研究顯示PICK1基因敲除小鼠對機械性刺激反

3、應減弱，但其對炎性疼痛的影響還不清楚。本實驗的目的就是觀察PICK1基因敲除后小鼠炎性痛覺行為是否改變。
　　 方法：應用PICK1基因敲除小鼠，皮下注射4%福爾馬林溶液造成炎性疼痛模型，與同窩野生型小鼠對比，觀察炎性痛覺行為的變化情況。
　　 結果：PICK1基因敲除后，其炎性痛覺行為學發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為對炎性疼痛更加耐受。
　　 1. PICK1基因敲除對頭面部炎性痛覺行為學的影響。
　　 單側面部

4、觸須墊皮下注射4%福爾馬林溶液后，與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠每3 min時間內(nèi)用同側前肢或后肢摩擦注射部位的行為明顯減少。
　　 2. PICK1基因敲除對足部炎性痛覺行為學的影響。
　　 ⑴采用熱板法測小鼠基礎痛閾，發(fā)現(xiàn)與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠基礎痛閾值明顯增高。
　　 ⑵單側足背皮下注射4%福爾馬林溶液后，與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠痛閾值明顯增高。

5、>　　 結論：
　　 1. PICK1基因敲除小鼠對福爾馬林導致的面部炎性疼痛的兩期耐受性均增加，即不僅對第一相的急痛反應耐受性增加，對炎癥反應所導致的第二相中樞敏感化也有抑制作用。
　　 2. PICK1基因敲除小鼠單側足背皮下注射4%福爾馬林溶液前后對熱刺激引發(fā)的縮足反應時間均明顯延長，提示PICK1基因敲除對生理性和炎性熱敏性疼痛耐受性均增強。
　　 第二部分：PICK1基因敲除對TG、DRG和脊髓背角A

6、SICs通道功能和表達的影響
　　 目的：酸敏感離子通道 (acid-sensing ion channels，ASICs)是ENaC/DEG (epithelial Na+channel/degenerin)通道超家族的成員之一，能被細胞外 pH下降或H+濃度上升直接激活。它廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，參與了很多重要的生理過程和病理反應，與學習記憶、突觸可塑性、腦缺血、疼痛等關系密切。H+激活ASICs可使神經(jīng)元去極

7、化，產(chǎn)生動作電位，參與了組織酸化如缺血、炎癥、腫瘤、癲癇等時痛覺的感受。由中度pH降低所誘發(fā)的皮膚表面酸誘導疼痛主要是由ASICs介導的，而更強的酸化引起的疼痛則是ASICs和TRPV1共同參與。目前已克隆出的ASICs主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。PICK1通過其PDZ結構域與ASIC1和ASIC2相互作用，對ASICs功能的發(fā)揮起到重要作用，但PICK1與外周和中樞感覺神經(jīng)元A

8、SICs之間具體作用如何以及有何意義？在上文中我們已經(jīng)證實PICK1基因敲除小鼠對炎性疼痛的耐受性增強，它的具體機制是什么？是否與ASICs有關？這些都值得我們?nèi)ミM一步探討。
　　 方法：采用western blotting、全細胞膜片鉗、鈣影像技術和免疫熒光組織化學技術，觀察PICK1基因敲除前后，外周初級感覺神經(jīng)元和脊髓背角上ASICs的蛋白表達和功能的變化情況，探討可能的機制。
　　 結果：PICK1基因敲除后AI

9、SC1的功能和蛋白表達均降低而AISC3的功能和蛋白表達均無變化。
　　 1. PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上AISC1電流幅度減小，全細胞膜片鉗結果顯示野生型AISC1電流幅度為2.37±0.46nA，PICK1基因敲除后AISC1電流幅度減少為1.21±0.35 nA（n=7，p<0.05 vs wild type）。PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上通過ASIC1通道誘導的胞內(nèi)鈣升高減少。將細胞外液由pH 7.4迅速轉

10、換成pH 6.0時，野生型△[Ca2+]/[Ca2+]比值為0.218±0.034 (n=11 from 2 animals)，純合子為0.131±0.020 (n=10 from 2 animals，p<0.05 vs wild type)。將細胞外液由pH 7.4迅速轉換成pH 5.0時，野生型△[Ca2+]/[Ca2+]比值為0.818±0.204 (n=18 from 3 animals)，純合子為0.379±0.091 (n=

11、18 from 4 animals，p<0.01 vs wild type)。
　　 2. PICK1缺失造成的ASIC1功能損傷可能是由于ASIC1蛋白表達總量的減少所致，使其在細胞內(nèi)的分布均勻減少，但其亞細胞定位并無改變。Western blotting和免疫熒光的結果均顯示，小鼠TG、DRG和脊髓背角上ASIC1蛋白表達總量和熒光強度均減少，但分布并未改變，仍在細胞膜上和胞漿內(nèi)均勻分布(n=6)。
　　 3. PI

12、CK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上ASIC3和TRPV1的表達和功能無變化。膜片鉗實驗結果顯示：PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上ASIC3和TRPV1電流幅值均無明顯變化（ASIC3：WT 2.59±0.41nA vs KO 2.43±0.39 nA，n=8，p＞0.05；TRPV1：WT 1314±268.3pA vs KO 1256±272.4pA，n=4，p＞0.05）；Western blotting和免疫熒光的結果均顯示，小鼠T

13、G、DRG上無論是ASIC3還是TRPV1的蛋白表達量都未發(fā)生改變；ASIC3和TRPV1在細胞膜上和胞漿內(nèi)均勻分布(n=6 for ASIC3 and n=3 for TRPV1)。
　　 結論：
　　 1. PICK1基因敲除造成ASICs的功能損傷。PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上AISC1電流幅度減小，通過ASIC1通道誘導的胞內(nèi)鈣升高減少。根據(jù)不同ASIC亞單位的分布和特性，推測這一作用主要是通過ASIC1a

14、同聚體來實現(xiàn)，而與TRPV1和ASIC3無關。
　　 2. PICK1缺失造成的ASICs功能損傷可能是由于ASIC1蛋白表達總量的減少所致，使其在細胞內(nèi)的分布均勻減少，但其亞細胞定位并無改變。
　　 第三部分：PICK1對炎性痛時ASICs的作用及相關機制
　　 目的：炎性疼痛的產(chǎn)生一是由于一些致痛物質(zhì)的釋放，如緩激肽、前列腺素、P物質(zhì)、降鈣素基因相關肽等；另一方面，由于炎癥局部pH降低，可激活外周傷害感受器，

15、引起傷害性感受器神經(jīng)元產(chǎn)生失活速率較慢的長時程去極化，促使痛覺過敏的產(chǎn)生。在外周炎癥模型中，脊髓背角神經(jīng)元中ASIC1a蛋白表達明顯增加，抑制其表達可產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛效果。在神經(jīng)系統(tǒng)，PICK1通過其特有的PDZ區(qū)域與PKCα結合，一方面可以促進PICK1的定位和作用發(fā)揮，另一方面，PICK1在PKC功能的發(fā)揮中也有重要作用。與PKC相同的是，PKA對ASICs功能的調(diào)節(jié)作用也需要PICK1來介導。
　　 我們通過行為學實驗已經(jīng)證實

16、，PICK1基因敲除小鼠對福爾馬林導致的面部炎性疼痛和足部炎性熱敏性疼痛耐受性均增加，但是其具體機制還不是很清楚。前面實驗結果提示PICK1基因的缺失會影響生理情況下ASICs蛋白表達、細胞定位、電流幅度以及鈣的釋放，那么，在炎癥時PICK1對ASICs的作用是怎樣的？是否參與了PICK1對炎性痛覺行為學的作用？除了ASICs外一些炎性致痛物質(zhì)和PKA、PKC是否也參與了PICK1對炎性痛覺行為學的作用？這些也值得我們?nèi)ミM一步探討。

17、r>　　 方法：采用整體動物實驗和免疫熒光組織化學技術，觀察PICK1基因敲除前后，ASICs、PKA、PKC、SP、CGRP的表達和分布情況，探討PICK1影響炎性痛覺行為學可能的機制。
　　 結論：
　　 1. 給予4%福爾馬林皮下注射后，小鼠TG、DRG和脊髓背角 ASIC1和ASIC3的表達均增加。不論是生理情況還是炎癥時，PICK1基因敲除可減少TG、DRG和脊髓背角ASIC1的表達和分布，但是PICK1缺失