Sirt1對5-6腎切除大鼠的保護作用及相關(guān)機制探討.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Sirt1激動劑Resveratrol對5/6腎切除大鼠的保護作用和TGF-β/Smad信號通路的影響
　　目的:纖維化在慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，Resveratrol(RSV)可以激活去乙酰酶Sirt1，并具有抗氧化和抗纖維化的特性。本文觀察RSV對5/6腎切除大鼠腎臟的保護作用及對TGF-β/Smad信號通路的影響。
　　方法:雄性SD大鼠180-200

2、g，二步法建立5/6腎切除模型，隨機分為三組:A:假手術(shù)組（Sham組）;B:5/6腎切除組（Nx組）;C;5/6腎切除＋RSV治療組（Nx＋RSV組），術(shù)后1周開始給予生理鹽水或RSV(20mg·kg-1·d-1)灌胃至術(shù)后12周。建模后每四周使用代謝籠收集24h尿液檢測24h尿蛋白定量，0、4、8、12周測大鼠尾動脈血壓，12周后腹腔麻醉動物，腹主動脈采血檢測血肌酐(S Cr)，尿素氮(BUN)。腎組織固定、切片后行PAS、MASS

3、ON染色觀察腎臟病理變化，TGF-β、CTGF、Fibronectin、Collagen-Ⅰ、α-SMA免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠纖維化改變。Western blot和Realt ime PCR檢測Fibronectin、Collagen-Ⅰ、TGF-β、Smad3和磷酸化Smad3水平。免疫共沉淀檢測Sirt1與乙?；疭mad3的相互作用。
　　結(jié)果:(1)與Sham組相比，Nx組在術(shù)后12周尿蛋白顯著增加(152.14±30

4、.48 mg/day vs25.34±7.54 mg/day)，伴腎功能減退:血肌酐(111.6±21.5μmol/L vs53.9±11.6μmol/L)和血尿素氮(16.75±3.99 mmol/L vs8.03±1.2mmol/L)水平升高。RSV治療顯著減輕尿蛋白(79.87±34.27 mg/day)，降低血肌酐(83±14.69μmol/L)和血尿素氮(11.95±1.88 mmol/L)水平。Nx組大鼠尾動脈血壓較Sham

5、組顯著升高，RSV可以降低大鼠尾動脈血壓(P＜0.05)。(2)腎小球硬化指數(shù)和小管間質(zhì)纖維化指數(shù)在Nx組顯著增加(1.56±0.34 vs0.35±0.08;1.47±0.29 vs0.18±0.04)， RSV治療顯著改善腎小球硬化指數(shù)和小管間質(zhì)纖維化指數(shù)。(3)免疫組化、Western blot和Realtime PCR結(jié)果顯示Nx組大鼠Fibronectin、Collagen-Ⅰ和TGF-β的表達較Sham組均上調(diào)，而RSV治療

6、能顯著下調(diào)Fibronectin、Collagen-Ⅰ和TGF-β的表達。(4) Western blot結(jié)果顯示Nx組大鼠磷酸化Smad3的表達較Sham組顯著升高，但RSV治療并未顯著改善磷酸化Smad3的升高。免疫共沉淀研究結(jié)果顯示Sirt1與Smad3相互作用，Nx組大鼠Sirt1與乙?；疭mad3結(jié)合較Sham組下降，RSV治療能顯著改善Sirt1與Smad3結(jié)合，并且RSV治療能下調(diào)Nx組大鼠升高的乙酰化Smad3水平。

7、r>　　結(jié)論:本研究結(jié)果顯示RSV可能通過下調(diào)5/6腎切除大鼠TGF-β和乙?；疭mad3的表達，從而改善5/6腎切除大鼠腎功能、蛋白尿、腎臟病理和纖維化等指標(biāo)，其作用可能與激活Sirt1有關(guān)。
　　第二部分 Sirt1對TGF-β誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞的保護作用和TGF-β/Smad信號通路的影響
　　目的:研究Sirt1對TGF-β誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞的保護作用和TGF-β/Smad信號通路的影響。
　　方法:(1)體外

8、培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞(MMC)，分別給予不同濃度(0、1、2、5ng/mL)和不同時間(0、6、12、24h)的TGF-β誘導(dǎo)MMC后提取細(xì)胞蛋白，Western blot和Realtime PCR檢測 Fibronectin、Collagen-Ⅰ表達。2ng/mL的TGF-β誘導(dǎo)MMC，并予不同濃度的RSV（10、25、50μM）干預(yù)MMC24h后提取細(xì)胞蛋白并檢測Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達。
　　(2

9、)分別采用以慢病毒為載體的RNA干擾或過表達技術(shù)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MMC，并予TGF-β刺激，RSV干預(yù)24-48h后提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測Sirt1、Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達。
　　(3)體外培養(yǎng)MMC，分別予0、1、2ng/mL的TGF-β誘導(dǎo)MMC，并予10、25μM的RSV干預(yù)MMC3h后提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測Smad3、磷酸化Smad3和乙?；疭mad3的表達

10、，免疫共沉淀檢測Sirt1與Smad3的相互作用。
　　(4)采用以慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MMC，并予TGF-β刺激3h后提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測Sirt1的表達，免疫沉淀法檢測Smad3和乙?；疭mad3的表達。
　　(5)采用以慢病毒為載體的RNA干擾轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MMC，同時轉(zhuǎn)染pRL-TK質(zhì)粒和Smad3/4-responsive promoter p(CAGA)12-Lucif

11、erase質(zhì)粒，當(dāng)轉(zhuǎn)染并同步化16h后給予TGF-β刺激，RSV干預(yù)，24h后按照熒光素酶啟動子基因測定試劑盒操作步驟測定p(CAGA)12熒光素酶的活性。
　　結(jié)果:(1)在體外培養(yǎng)的MMC中，TGF-β的誘導(dǎo)可呈時間與劑量依賴性上調(diào)Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達，RSV干預(yù)可顯著下調(diào)TGF-β誘導(dǎo)的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達，其作用呈劑量依賴性。
　　(2) RSV顯著下調(diào)TG

12、F-β誘導(dǎo)MMC的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達，采用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)下調(diào)Sirt1的表達則顯著減輕RSV的保護作用，而采用過表達技術(shù)上調(diào)Sirt1的表達則顯著減輕TGF-β誘導(dǎo)的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達，提示RSV的作用與激活SIRT1有關(guān)。
　　(3)在體外培養(yǎng)的MMC中，TGF-β的誘導(dǎo)可顯著上調(diào)乙?；疭mad3和磷酸化Smad3的表達，RSV干預(yù)可下調(diào)TGF-β誘導(dǎo)的乙

13、?；疭mad3表達，而對磷酸化Smad3的表達影響不大。免疫共沉淀結(jié)果顯示RSV干預(yù)可增加Sirt1與Smad3結(jié)合。
　　(4)采用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)下調(diào)Sirt1的表達可增加TGF-β誘導(dǎo)MMC乙?；疭mad3表達，這與Sirt1的去乙?；δ芟嘁恢?。
　　(5)在體外培養(yǎng)的MMC中，RSV能減少TGF-β誘導(dǎo)的Smad3啟動子熒光素酶的活性。采用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)下調(diào)Sirt1的表達則顯著減輕RSV的這種作

14、用。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果顯示RSV可下調(diào)TGF-β誘導(dǎo)MMC的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達和Smad3啟動子熒光素酶的活性，其作用可能與激活Sirt1，下調(diào)乙?；疭mad3，降低Smad3轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。
　　第三部分 Sirt1敲除的雜合子（Sirt1+/-）小鼠與野生型（Sirt1+/+）小鼠對5/6腎切除的耐受性
　　目的:觀察Sirt1敲除的雜合子（Sirt1+/-）小鼠與野生型(Sirt

15、1+/+)小鼠對5/6腎切除的蛋白尿、腎功能、腎臟病理和纖維化等指標(biāo)的影響。
　　方法:雄性Sirt1+/-小鼠與Sirt1+/+小鼠18-20g，二步法建立5/6腎切除模型，隨機分為四組:A:Sirt1+/+假手術(shù)組（WT-Sham組）;B:Sirt1+/-假手術(shù)組（KO-Sham組）;C:Sirt1+/+5/6腎切除組（WT-Nx組）;D;Sirt1+/-5/6腎切除組（KO-Nx組）。建模后每四周使用代謝籠收集24h尿液檢測

16、24h尿蛋白定量，術(shù)后12周腹腔麻醉動物，腹主動脈采血檢測血尿素氮(BUN)。腎組織固定、切片后行PAS、MASSON染色觀察腎臟病理變化，TGF-β、Collagen-Ⅰ、α-SMA免疫組織化學(xué)染色觀測各組大鼠纖維化改變。Western blot檢測Fibronectin、Collagen-Ⅰ和Sirt1的表達。
　　結(jié)果:(1)與WT-Sham組相比，WT-Nx組在術(shù)后12周尿蛋白顯著增加，伴血尿素氮水平升高(P＜0.05)。

17、而KO-Nx組尿蛋白和血尿素氮水平較WT-Nx組升高更明顯(P＜0.05)。
　　(2) WT-Nx組腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化程度較WT-Sham組明顯增加，而KO-Nx組較WT-Nx組纖維化程度更重。
　　(3)免疫組化、Western blot結(jié)果顯示W(wǎng)T-Nx組小鼠TGF-β、Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表達較WT-Sham組均上調(diào)，而KO-Nx組TGF-β、Fibronectin、Collagen