DIXDC1基因在胃癌侵襲轉移中的作用及相關機制研究.pdf

1、胃癌仍是我國的第二大腫瘤。大部分患者確診時已達中晚期。而局部復發(fā)和轉移是胃癌死亡率較高的主要原因。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，許多研究致力于尋找腫瘤侵襲轉移過程中的關鍵分子，并通過干預這些分子控制腫瘤的轉移。
　　DIXDC1是以Wnt通路核心分子Axin2的C-末端為誘餌，通過酵母雙雜交實驗篩選出的與Axin2 C-末端相互作用的一個蛋白;是Wnt通路的正調控因子Ccdl(Coiled-coil-DIX1)基因人類的異構體。研究顯

2、示DIXDC1屬于actin和tubulin等細胞骨架蛋白家族，可能參與細胞形態(tài)和運動的調節(jié)。而在腫瘤中關于DIXDC1的報道較少，課題組前期的工作證實其可以通過上調cyclin D1、下調p21表達促進大腸癌細胞周期G0/G1到S期的轉化，從而促進大腸癌細胞的增殖和腫瘤的形成，同時PI3K信號通路參與其促大腸癌細胞增殖的過程。
　　目的:
　　研究DIXDC1在不同組織類型胃癌中的表達情況并分析其與臨床病理參數(shù)的相關性;探

3、索DIXDC1在胃癌侵襲和轉移等惡性生物學行為中的作用及其初步的分子生物學機制。
　　方法:
　　免疫組織化學檢測DIXDC1在胃癌石蠟組織標本中的表達;Western Blot檢測多種胃癌細胞系中DIXDC1的表達;建立DIXDC1過表達質粒，并包裝慢病毒載體，對低表達DIXDC1的胃癌細胞系進行感染，建立穩(wěn)定表達DIXDC1的胃癌細胞系;利用劃痕實驗、Transwell侵襲實驗研究DIXDC1對胃癌遷移、侵襲能力的影響;

4、Western Blot檢測過表達DIXDC1后胃癌細胞中腫瘤侵襲轉移相關蛋白變化;雙熒光素酶報告實驗驗證DIXDC1對β-catenin/TCF轉錄活性的影響;免疫共沉淀明確DIXDC1與β-catenin相互作用關系;共聚焦顯微鏡觀察DIXDC1和β-catenin在胃癌細胞中的亞細胞定位;Western Blot方法檢測DIXDC1對β-catenin磷酸化及核蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1、DIXDC1在胃癌組

5、織中表達上調并且與胃癌TNM分期、淋巴結轉移相關。利用免疫組織化學檢測DIXDC1在在66例胃癌組織及28例上皮內瘤變組織中的表達，發(fā)現(xiàn)DIXDC1在胃癌組織中的陽性率為56.0％(37/66)，在上皮內瘤變組織中陽性率為28.6％(8/28)，而在正常胃組織中不表達?？ǚ椒治鲲@示DIXDC1的表達與胃癌臨床分期、淋巴轉移及組織學類型均相關。在94例胃癌及其癌前病變組織中，29.8％出現(xiàn)β-catenin在細胞核內表達，Spearman

6、相關性分析顯示DIXDC1的陽性表達與β-catenin在胃癌細胞中的核定位相關。
　　2、過表達DIXDC1基因可顯著促進胃癌細胞的遷移與侵襲能力，干擾DIXDC1基因則抑制胃癌細胞遷移能力。
　　通過構建DIXDC1過表達慢病毒載體，感染胃癌細胞，成功建立了穩(wěn)定高表達DIXDC1的胃癌細胞系BGC823-DIXDC1和陰性對照株BGC823-vector。劃痕實驗、Transwell遷移及侵襲實驗顯示過表達DIXDC1基

7、因后，BGC823細胞遷移和侵襲能力明顯增高。設計合成DIXDC1干擾siRNA，并轉染高表達DIXDC1的胃癌細胞株HGC27，Transwell遷移實驗顯示DIXDC1基因被干擾后HGC27細胞遷移能力明顯下降。Western Blot檢測顯示DIXDC1過表達的胃癌細胞中，腫瘤侵襲轉移相關蛋白MMP3、MMP7表達有所增高，而caveolin-1、E-cadherin蛋白表達下降。上述結果提示，DIXDC1基因可顯著促進胃癌細胞的

8、遷移與侵襲能力。
　　3、DIXDC1通過抑制激酶GSK-3β的活性，下調β-catenin蛋白的磷酸化水平，并促進β-catenin入核堆積，從而促進胃癌的侵襲轉移。
　　雙熒光素酶報告實驗顯示過表達DIXDC1可以增加β-caenin/TCF啟動子轉錄活性，而免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)DIXDC1與β-catenin在胃癌細胞內確實存在相互作用關系。過表達DIXDC1后，β-catenin蛋白磷酸化水平下降，而細胞中蛋白總量及核蛋白

9、表達增加，免疫熒光進一步證實過表達DIXDC1后β-catenin在細胞核中表達增多。而過表達DIXDC1可影響磷酸化β-catenin的激酶GSK-3β的活性。提示DIXDC1可能通過調節(jié)激酶GSK-3β的活性，抑制其對β-catenin蛋白的磷酸化，并促進β-catenin入核堆積，從而促進胃癌的侵襲轉移。
　　結論:
　　DIXDC1在胃癌組織中高表達，且與胃癌組織類型、淋巴結轉移、腫瘤大小等臨床病例指標相關;過表達D