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文檔簡(jiǎn)介
1、胃癌仍是我國(guó)的第二大腫瘤。大部分患者確診時(shí)已達(dá)中晚期。而局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌死亡率較高的主要原因。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,許多研究致力于尋找腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵分子,并通過(guò)干預(yù)這些分子控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
DIXDC1是以Wnt通路核心分子Axin2的C-末端為誘餌,通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出的與Axin2 C-末端相互作用的一個(gè)蛋白;是Wnt通路的正調(diào)控因子Ccdl(Coiled-coil-DIX1)基因人類(lèi)的異構(gòu)體。研究顯
2、示DIXDC1屬于actin和tubulin等細(xì)胞骨架蛋白家族,可能參與細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。而在腫瘤中關(guān)于DIXDC1的報(bào)道較少,課題組前期的工作證實(shí)其可以通過(guò)上調(diào)cyclin D1、下調(diào)p21表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞周期G0/G1到S期的轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成,同時(shí)PI3K信號(hào)通路參與其促大腸癌細(xì)胞增殖的過(guò)程。
目的:
研究DIXDC1在不同組織類(lèi)型胃癌中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;探
3、索DIXDC1在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中的作用及其初步的分子生物學(xué)機(jī)制。
方法:
免疫組織化學(xué)檢測(cè)DIXDC1在胃癌石蠟組織標(biāo)本中的表達(dá);Western Blot檢測(cè)多種胃癌細(xì)胞系中DIXDC1的表達(dá);建立DIXDC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,并包裝慢病毒載體,對(duì)低表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系進(jìn)行感染,建立穩(wěn)定表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系;利用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究DIXDC1對(duì)胃癌遷移、侵襲能力的影響;
4、Western Blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)DIXDC1后胃癌細(xì)胞中腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白變化;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DIXDC1對(duì)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性的影響;免疫共沉淀明確DIXDC1與β-catenin相互作用關(guān)系;共聚焦顯微鏡觀察DIXDC1和β-catenin在胃癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位;Western Blot方法檢測(cè)DIXDC1對(duì)β-catenin磷酸化及核蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果:
1、DIXDC1在胃癌組
5、織中表達(dá)上調(diào)并且與胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)DIXDC1在在66例胃癌組織及28例上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)DIXDC1在胃癌組織中的陽(yáng)性率為56.0%(37/66),在上皮內(nèi)瘤變組織中陽(yáng)性率為28.6%(8/28),而在正常胃組織中不表達(dá)??ǚ椒治鲲@示DIXDC1的表達(dá)與胃癌臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及組織學(xué)類(lèi)型均相關(guān)。在94例胃癌及其癌前病變組織中,29.8%出現(xiàn)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),Spearman
6、相關(guān)性分析顯示DIXDC1的陽(yáng)性表達(dá)與β-catenin在胃癌細(xì)胞中的核定位相關(guān)。
2、過(guò)表達(dá)DIXDC1基因可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力,干擾DIXDC1基因則抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。
通過(guò)構(gòu)建DIXDC1過(guò)表達(dá)慢病毒載體,感染胃癌細(xì)胞,成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞系BGC823-DIXDC1和陰性對(duì)照株BGC823-vector。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)DIXDC1基
7、因后,BGC823細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增高。設(shè)計(jì)合成DIXDC1干擾siRNA,并轉(zhuǎn)染高表達(dá)DIXDC1的胃癌細(xì)胞株HGC27,Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示DIXDC1基因被干擾后HGC27細(xì)胞遷移能力明顯下降。Western Blot檢測(cè)顯示DIXDC1過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞中,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP3、MMP7表達(dá)有所增高,而caveolin-1、E-cadherin蛋白表達(dá)下降。上述結(jié)果提示,DIXDC1基因可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的
8、遷移與侵襲能力。
3、DIXDC1通過(guò)抑制激酶GSK-3β的活性,下調(diào)β-catenin蛋白的磷酸化水平,并促進(jìn)β-catenin入核堆積,從而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)DIXDC1可以增加β-caenin/TCF啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,而免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)DIXDC1與β-catenin在胃癌細(xì)胞內(nèi)確實(shí)存在相互作用關(guān)系。過(guò)表達(dá)DIXDC1后,β-catenin蛋白磷酸化水平下降,而細(xì)胞中蛋白總量及核蛋白
9、表達(dá)增加,免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)過(guò)表達(dá)DIXDC1后β-catenin在細(xì)胞核中表達(dá)增多。而過(guò)表達(dá)DIXDC1可影響磷酸化β-catenin的激酶GSK-3β的活性。提示DIXDC1可能通過(guò)調(diào)節(jié)激酶GSK-3β的活性,抑制其對(duì)β-catenin蛋白的磷酸化,并促進(jìn)β-catenin入核堆積,從而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
結(jié)論:
DIXDC1在胃癌組織中高表達(dá),且與胃癌組織類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等臨床病例指標(biāo)相關(guān);過(guò)表達(dá)D
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