內(nèi)臟脂肪素對人內(nèi)皮祖細(xì)胞致炎作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:內(nèi)皮功能障礙和炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)能增加內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule1，ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion m

2、olecule 1，VCAM-1)的mRNA表達(dá)，但Visfatin是否能增加EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，進(jìn)而損傷EPCs修復(fù)能力尚未可知。本研究采用外源性重組人Visfatin刺激EPCs，觀察細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的變化，并用核因子kB(Nuclear factor kappa B，NF-kB)通道抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）處

3、理細(xì)胞，探討外源性人Visfatin對EPCs的致炎作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、體外分離培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞
　　 取健康足月剖腹產(chǎn)婦新鮮臍帶血，用等體積PBS緩沖液稀釋，加入一定體積的人淋巴細(xì)胞分離液，室溫2000rpm/min離心25分鐘分離獲得人單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclearcells，MNCs)，密度1×106/ml接種于纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)包被的培養(yǎng)瓶中，人EPCs

4、專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)變化，并記錄，第3天換液，棄未貼壁細(xì)胞，第7天時(shí)傳代。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD34、CD133、CD309三陽性細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)和FITC標(biāo)記荊豆凝集素(FITC-UEA-(I))雙染色的細(xì)胞。
　　 2、Visfatin刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞
　　 培養(yǎng)7-10天的細(xì)胞傳代后鋪6孔

5、板，實(shí)驗(yàn)分為4組①Control（對照組）;②Visfatin(10ng/ml)③Visfatin(20ng/ml)④Visfatin(50ng/ml)。Visfatin孵育EPCs24小時(shí)后以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1mRNA的量，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表達(dá)，48小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面ICA

6、M-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)量。
　　 3、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)對Visfatin刺激EPCs的作用
　　 培養(yǎng)7-10天的細(xì)胞傳代后鋪6孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組①Control（對照組）;②Visfatin(50ng/ml)③PDTC組(100uM)④PV[PDTC(100uM)+Visfatin（50ng/ml）]。PDTC100uM預(yù)處理EPCs2小時(shí)后，Visfatin孵育EPCs24小時(shí)，RT-PCR

7、檢測各組ICAM-1和VCAM-1mRNA的量，48小時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1、人單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)后細(xì)胞呈圓形，多數(shù)懸浮在培養(yǎng)液中，3-4天后細(xì)胞逐漸貼壁，約40-50％貼壁細(xì)胞呈梭形，5-7天貼壁細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞集落，10-14天細(xì)胞呈“鋪路石”樣外形，增殖能力強(qiáng)。
　　 2、培養(yǎng)7天時(shí)大部分細(xì)胞能夠結(jié)合FITC-UEA-(I)，并吞噬D

8、il-acLDL，雙熒光染色實(shí)驗(yàn)陽性。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)7天EPCs表面CD34、CD133、CD309表達(dá)率分別為43.12％，36.03％和67.76％。
　　 4、Visfatin對EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的影響:Visfatin刺激EPCs后ICAM-1和VCAM-1的mRNA的量增加，隨著Visfatin濃度的增加，EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1mRNA的量隨之

9、增加，呈一定的量-效關(guān)系。
　　 5、Visfatin對EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平的影響:Visfatin刺激EPCs后流式細(xì)胞儀檢測4組（0，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml）細(xì)胞表面ICAM-1蛋白的表達(dá)量分別為18.25±3.77％，25.40±4.25％，38.88±4.02％和48.83±5.12％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);VCAM-1蛋白的表達(dá)量分別為6.75±2.07

10、％，10.65±2.33％，17.11±2.37％和24.82±3.19％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，均呈一定的量-效關(guān)系。
　　 6、PDTC對Visfatin刺激EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的影響:PV組與Visfatin(50ng/ml)組比較，ICAM-1和VCAM-1的mRNA的量下降。
　　 7、PDTC對Visfatin刺激EPCs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平的影

11、響:ICAM-1蛋白的表達(dá)量PV組低于Visfatin(50ng/ml)組（45.25±2.95％vs18.44±1.97％），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);VCAM-1蛋白的表達(dá)量:PV組低于Visfatin(50ng/ml)組（22.92±2.46％vs6.82±1.79％），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);Control組和PDTC組的ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論: