羊癢病免疫組織化學(xué)檢測方法建立及區(qū)分牛、羊PrP的單抗2H3的特性研究.pdf

1、羊癢病的檢測方法為單克隆抗體介導(dǎo)的免疫學(xué)反應(yīng)，包括ELISA、western blotting和免疫組織化學(xué)(IHC)等方法，同時結(jié)合腦組織組織病理學(xué)觀察。本研究通過大腸桿菌融合表達(dá)PrP27-30蛋白，制備特異性單克隆抗體，初步尋找單克隆抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，對所得單克隆抗體進(jìn)行免疫學(xué)特性分析，選取最佳單克隆抗體，建立我國的羊癢病免疫組化檢測方法，并對我國部分地區(qū)采集樣品進(jìn)行普查，在我國羊癢病的監(jiān)測方面做了比較系統(tǒng)的工作；另外本研究利用突

2、變技術(shù)突變單抗2H3結(jié)合位點(diǎn)，首次提出并證明羊PrP208位點(diǎn)在不同物種間存在I/M的多態(tài)性，這一多態(tài)性導(dǎo)致2H3單抗對不同物種PrP親和力存在差異。 本實(shí)驗(yàn)利用PCR方法從小尾寒羊基因組DNA中擴(kuò)增PrP27-30編碼基因，并克隆到硫氧還原蛋白融合表達(dá)載體pET32a上，轉(zhuǎn)化至E. collBL21，IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)，得到相對分子質(zhì)量約為35kD的重組小尾寒羊PrP27-30融合蛋白。以純化的重組小尾寒羊PrP27-30融

3、合蛋白免疫PrP<'c>基因敲除小鼠，經(jīng)過兩次加強(qiáng)免疫，通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，取脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備出抗小尾寒羊PrP27-30單克隆抗體，經(jīng)三次亞克隆，篩選出六株能穩(wěn)定分泌針對小尾寒羊PrP27-30特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，以相鄰肽段間每間隔15個氨基酸(PrP-peptide 2除外)，共6段肽段來分段表達(dá)小尾寒羊PrP27-30，分別命名為PrP-peptide 1、Pr

4、P-peptide 2、PrP-peptide 3、PrP-peptide 4、PrP-peptide 5和PrP-peptide 6。將6段融合蛋白分別與羊癢病單克隆抗體進(jìn)行Western blotting反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)情況分析單克隆抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的大概位置，初步得到了待檢5株羊癢病單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其所在位置分別為：2H3在199aa-213aa之間、4C6在153aa-154aa左右、5F11在154aa-168aa之間

5、、7F1在214aa-227aa之間、7F11在154aa-168aa之間。 對2H3、4C6、5F11和7F11四株單克隆抗體與牛、羊PrP<'c>的ELISA反應(yīng)特性，與牛和羊PrP<'c>和PrP<'Sc>的Western blotting、免疫組化反應(yīng)特性等幾個方面進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和分析。結(jié)果顯示，2H3對羊PrP<'c>和PrP<'sc>顯示了較強(qiáng)的反應(yīng)性，對牛PrP<'c>和PrP<'sc>無反應(yīng)；4C6對牛和羊Pr

6、P<'c>和PrP<'sc>都有較強(qiáng)反應(yīng)性；5F11和7F11顯示出相似的反應(yīng)特性，對羊PrP<'c>和PrP<'sc>反應(yīng)性較強(qiáng)，而對牛PrP<'c>和PrP<'sc>次之，抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果與單抗的反應(yīng)特性相一致。比較清楚的了解了四株單抗的免疫學(xué)特性，為每株單抗供不同用途使用提供了理論依據(jù)。根據(jù)單抗2H3免疫學(xué)特性，利用NCBI中BLAST功能比對單抗結(jié)合抗原區(qū)段氨基酸的差別，發(fā)現(xiàn)羊PrP208位點(diǎn)表現(xiàn)有種屬特異性，推測此位點(diǎn)可能影響

7、2H3免疫學(xué)特性；利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含有2H3單抗結(jié)合區(qū)段的PrP肽段，在PCR引物中引入突變，將小尾寒羊PrP208位點(diǎn)的異亮氨酸I突變?yōu)榕rP208位點(diǎn)蛋氨酸M，與未引入突變的同一段小尾寒羊PrP肽段一起與2H3進(jìn)行Western blotting反應(yīng)，結(jié)果顯示2H3不與突變后的PrP肽段發(fā)生反應(yīng)，但與未引入突變的同一肽段發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果說明，2H3的主要抗原結(jié)合位點(diǎn)為羊208位點(diǎn)的I，此位點(diǎn)的種屬差異是造成2H3單抗具有

8、免疫學(xué)特性的原因，結(jié)果同時也說明2H3在動物朊毒體蛋白研究上具有特殊意義。 在以上研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以自制單抗為核心試劑，優(yōu)化各步驟反應(yīng)的最佳條件，建立具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的羊癢病免疫組化檢測方法，并采集我國部分省、市、自治區(qū)羊腦樣品，利用建立的羊癢病免疫組化檢測方法對我國羊癢病進(jìn)行普查。在2005年檢測的3211頭份樣品和2006年檢測的1711頭份樣品中，所有4922頭份檢測樣品均顯示為陰性，初步說明我國目前尚無羊癢病的發(fā)