西洋參莖葉總皂苷對(duì)冠心病胰島素敏感性影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：IR是聯(lián)系冠心病、糖尿病、高血壓、血脂異常等多種代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。大量研究表明，IR可通過(guò)繼發(fā)高胰島素血癥、糖脂質(zhì)代謝異常、高血壓、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、SMC增生、血小板活化、凝血/纖溶系統(tǒng)異常等途徑，參與CHD的發(fā)病，是CHD的重要危險(xiǎn)因素之一。重視胰島素抵抗的處理、增加機(jī)體胰島素敏感性有助于改善代謝異常并減輕血管病變。冠心病的防治思想不僅在于改善血管壁的病變、增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，還應(yīng)注意早期干預(yù)，改善胰島素抵

2、抗。 西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliussaponin，PQS)是從國(guó)產(chǎn)西洋參莖葉中提取的活性成分，其莖葉部總皂苷、氨基酸、無(wú)機(jī)元素含量明顯高于根部。1999年衛(wèi)生部組織全國(guó)十家三甲醫(yī)院進(jìn)行西洋參莖葉皂苷制劑治療冠心病和糖尿病的多中心雙盲對(duì)照的臨床觀察，證明PQS確實(shí)同時(shí)具有調(diào)整脂質(zhì)代謝、降低血糖和改善心肌缺血的作用，這在現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)的治療藥物中尚不多見(jiàn)。那么，該藥調(diào)脂降糖機(jī)制是什么?是否存在共同機(jī)制?其作用是

3、否是通過(guò)增加胰島素敏感性、改善胰島素抵抗而實(shí)現(xiàn)的?為此，本課題實(shí)驗(yàn)研究將從糖--脂代謝的密切聯(lián)系出發(fā)，以胰島素抵抗為中心，以脂肪細(xì)胞為模型來(lái)研究PQS調(diào)控的糖脂代謝，從脂肪細(xì)胞分化、脂肪分解以及對(duì)葡萄糖消耗和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同環(huán)節(jié)尋找西洋參莖葉總皂苷調(diào)脂降糖的作用靶點(diǎn)和作用途徑，將為該藥防治冠心病、糖尿病等代謝相關(guān)疾病提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。臨床研究將對(duì)其是否能夠增加冠心病血糖異?；颊邔?duì)胰島素的敏感性、改善其IR狀態(tài)和糖脂代謝，從而發(fā)揮

4、對(duì)冠心病的治療作用進(jìn)行驗(yàn)證；并初步探討冠心病血糖異?；颊咭葝u素敏感性變化與中醫(yī)證型的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)研究[實(shí)驗(yàn)一]目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體-γ(PPAR-γ)基因表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用含胰島素、異丁基-甲基-黃嘌呤(IMX)和地塞米松的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，采用相差顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)，用油紅O染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定、檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中脂

5、肪的堆積，采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中PPAR-γmRNA的表達(dá)。結(jié)果未誘導(dǎo)組在0、5、7、9天均未檢測(cè)到PPAR-γmRNA，誘導(dǎo)組及各藥物處理組則在5、7、9天均可見(jiàn)PPAR-γmRNA，且與單純誘導(dǎo)組相比，二甲雙胍及PQS三個(gè)劑量均有促進(jìn)PPAR-γ基因轉(zhuǎn)錄的趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)明顯差異(P＞0.05)。誘導(dǎo)組和各藥物處理組第9天PPAR-γmRNA量比第5、第7天低。 [實(shí)驗(yàn)二]目的：觀察西洋

6、參莖葉總皂苷(PQS)對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(GLUT-4)轉(zhuǎn)位和c-cb1結(jié)合蛋白(CAP)基因表達(dá)的影響。方法：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，用游離脂肪酸(FFA)制備胰島素抵抗(IR)模型，用液閃儀測(cè)定3H標(biāo)記的葡萄糖的攝取率，用免疫熒光法檢測(cè)GLUT-4轉(zhuǎn)位，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中CAPmRNA的表達(dá)。結(jié)果模型組胰島素刺激下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為2.14

7、3±0.472，顯著低于正常對(duì)照組4.993±0.917(P＜0.01)，二甲雙胍組、PQS大/中劑量組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率分別為4.180±0.717、3.942±0.492、3.160±0.450，與模型組相比差異顯著(P＜0.01)(P＜0.01)(P＜0.05)，PQS小劑量組作用不明顯。模型組在胰島素刺激前后，GLUT-4在細(xì)胞內(nèi)的分布無(wú)明顯變化；而正常對(duì)照組在胰島素刺激前，GLUT-4大部分位于胞漿，胰島素刺激30min后，胞漿內(nèi)的

8、分布較刺激前明顯減少，胞膜上分布相對(duì)增加。二甲雙胍組和PQS三個(gè)劑量組的結(jié)果與正常組相近。與正常組相比，模型組CAPmRNA水平明顯下降(P＜0.05)，經(jīng)二甲雙胍或PQS大、中劑量處理后，CAPmRNA水平明顯上升，與模型組相比差異顯著(P＜0.01)，PQS小劑量未見(jiàn)明顯效果。結(jié)論P(yáng)QS能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞CAP基因轉(zhuǎn)錄、GLUT-4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能與其改善脂肪細(xì)胞IR的作用有關(guān)，但PQS“促進(jìn)GLUT-4轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)”這一

9、作用是藥物的直接效應(yīng)還是通過(guò)影響FFA而發(fā)揮的間接效應(yīng)還有待進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。 [實(shí)驗(yàn)三]目的：觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖脂代謝的影響。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，用游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)制備胰島素抵抗(IR)模型，再加入相應(yīng)藥物作用，最后用western-blot法檢測(cè)胰島素刺激后信號(hào)蛋白磷酸化水平，用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)藥物作用后脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖

10、消耗量，用比色法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的脂解作用的影響。結(jié)果模型組胰島素受體β亞單位酪氨酸磷酸化水平、IRS-1酪氨酸磷酸化水平、PKB的Ser473磷酸化水平均較正常對(duì)照組減低；PQS小劑量組與模型組相比，信號(hào)蛋白磷酸化水平無(wú)明顯差異；但與模型組相比，PQS中、大劑量和二甲雙胍組信號(hào)蛋白磷酸化水平均有不同程度地增高。模型組葡萄糖消耗量為5.250±2.671，顯著低于正常對(duì)照組14.133±1.305(P＜0.01)

11、，二甲雙胍組、PQS大/中/小劑量組葡萄糖消耗量分別為11.807±1.358、10.784±2.373、10.217±1.237、9.984±2.006，與模型組相比均差異極顯著(P＜0.01)，且隨著PQS用藥劑量的增加，葡萄糖消耗量也逐漸增加。TNF-a組培養(yǎng)液中FFA濃度(2.479±0.597)顯著高于對(duì)照組(1.320±0.538)(P＜0.01)，予二甲雙胍和西洋參莖葉總皂苷大/中/小三個(gè)劑量處理后，培養(yǎng)液中FFA濃度均顯

12、著低于TNF-a組(P＜0.01)，分別為1.210±0.566、1.105±0.631、1.108±0.260、1.201±0.593，但各藥物治療組間相比FFA無(wú)顯著差異，且隨著PQS用藥劑量的加大，其抗脂解作用有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)論FFA誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，此時(shí)，胰島素刺激下的胰島素受體β亞單位酪氨酸磷酸化水平、信號(hào)蛋白IRS-1酪氨酸磷酸化水平和PKB的Ser473磷酸化水平降低，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，脂肪細(xì)胞攝取利用葡萄糖

13、障礙，葡萄糖消耗量減少，PQS中、大劑量和二甲雙胍均可不同程度地升高信號(hào)蛋白磷酸化水平，促進(jìn)脂肪細(xì)胞利用葡萄糖，但PQS所致的胰島素受體后改變是藥物的直接效應(yīng)還是通過(guò)影響FFA而發(fā)揮的間接效應(yīng)?還有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。 臨床研究：目的：觀察PQS對(duì)冠心病血糖異?；颊哐?、血脂及胰島素敏感性的影響，初步探討冠心病血糖異?；颊咭葝u素敏感性變化與中醫(yī)證型的關(guān)系。方法：選擇冠心病心絞痛并血糖異常(IFG/IGT/T2DM)患者84例

14、，隨機(jī)分為PQS組(43例)和常規(guī)西藥治療組(41例)。PQS組在西藥常規(guī)治療的同時(shí)加口服PQS，連續(xù)用藥治療4周，用藥前后檢測(cè)患者FPG、FINS、TC、TG、HDL、LDL，胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(FPG.FINS)；穩(wěn)態(tài)模型(Homamodel)的胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)和β細(xì)胞功能(Homa-β)分別為：Homa-IR=(FPG×FINS)/22.5，Homa-β=20×FINS/(FPG-3.5)。結(jié)果：兩組病

15、例在心絞痛療效、心電圖療效及中醫(yī)證候療效比較，無(wú)顯著差異。兩組治療后FPG均較治療前顯著下降(P＜0.01)，且PQS組FPG降低程度(25.80±12.72﹪)較常規(guī)西藥治療組(20.89±12.17﹪)稍高，但統(tǒng)計(jì)分析未達(dá)顯著差異(P＞0.05)。提示：在西藥常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用PQS，有進(jìn)一步降低冠心病血糖異?；颊哐堑淖饔泌厔?shì)。兩組治療后ISI水平雖均較治療前有所增高、Homa-IR有輕度降低，但統(tǒng)計(jì)分析均未達(dá)明顯差異(P＞0.

16、05)；組間ISI、Homa-IR無(wú)差異。治療組治療后Homa-β值(4.19±0.79)較治療前(3.48±0.76)有顯著增加(P＜0.01)，并顯著高于常規(guī)西藥治療組治療后的水平(3.82±0.77)(P＜0.05)；而常規(guī)西藥治療組治療前后Homa-β值無(wú)顯著變化，且治療前兩組組間比較Homa-β水平無(wú)顯著差異。PQS組治療后TC、LDL水平均較治療前顯著降低(P＜0.05)，且治療后TC水平(1.17±0.54)顯著低于常規(guī)西

17、藥治療組(1.42±0.49)(P＜0.05)；PQS組治療前后TG和HDL水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)；常規(guī)西藥治療組治療前后TC、LDL、TG和HDL水平均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。兩組間相比，治療前后TG、LDL、HDL水平均無(wú)顯著差異；提示：在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上加用PQS，可顯著降低冠心病血糖異?；颊哐猅C、LDL水平，效果優(yōu)于單純西藥治療組。中醫(yī)證型分析表明：冠心病血糖異?；颊邩?biāo)實(shí)證中，ISI由氣滯血瘀→寒凝血瘀→痰濁血