NGF-VEGF基因治療局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時間窗及MR影像學研究.pdf

1、第一部分：放射學引導下兔局灶性腦缺血再灌注模型的制作和質控體系的建立 目的：通過摸索兔局灶性腦缺血模型的制作方法，探討量化實驗動物模型制作的質量控制體系和評價體系，從而建立適合影像學評價的穩(wěn)定可控重復性好的兔局灶性腦缺血再灌注模型。 方法：實驗動物按照不同的量化指標分為六組，其中A組，不同品種的家兔；B組，不同的線栓；C組，不同栓塞時間(1h、2h、3h、4h)：D組，不同月齡(4-8月)、不同體重(2.0-5.0kg)

2、的家兔；E組，不同手術入路；F組，不同的再灌注時間。其中A組行頸內動脈血管造影；B-E組統(tǒng)計成功率、死亡率、進行神經(jīng)功能缺損評分及磁共振成像和形態(tài)學觀察；F組于再灌注后不同時間點對實驗動物進行神經(jīng)功能缺損評分、磁共振成像及TTC染色觀察。 結果：選用健康、雄性，體重2.5-3.0kg、4.5-5 月的新西蘭白兔作為實驗動物，直徑為0.53mm的導絲作為線栓材料，在X線透視引導下行大腦中動脈阻塞，同時術前、術中、術后嚴格監(jiān)控血氣、

3、血糖變化和其他影響因素，可有效地提高成功率、降低死亡率。綜合影像技術、神經(jīng)功能缺損評分及 TTC 染色是評價模型的理想體系。 結論：合理選擇實驗動物、量化影響因素、建立完善的術前、術中和術后三級評價體系，是建立穩(wěn)定、可控的實驗模型的必要條件，也是進一步開展缺血再灌注的病理生理變化的研究和MR影像學研究的基礎。 第二部分：多參數(shù)MRI動態(tài)評價兔局灶性腦缺血再灌注模型的時間和組織特征性 目的：利用多參數(shù)MRI研究兔局

4、灶性腦缺血再灌注模型，探討腦缺血再灌注不同時間點的動態(tài)變化規(guī)律。 方法：建立兔局灶性腦缺血再灌注模型，78 只雄性新西蘭白兔，隨機分為三組，其中A組6只，為空白對照組；B組12只，為假手術對照組；C組60只，為缺血再灌注組。采用改良頸內動脈線栓造模方法，將導絲置入頸內動脈，阻閉左側大腦中動脈2h后抽出導絲恢復再灌注，于再灌注后1h、3h、6h、1d、3d、7d(均n=10)對實驗動物進行行為評分、MRI、大體觀察、光鏡和電鏡檢查

5、。 結果：空白對照組、假手術組在各序列MRI上未見異常信號，模型組在缺血再灌注后不同時間均可在MRI表現(xiàn)出不同程度的腦組織損害征象。從再灌注Oh到7d所有實驗動物組織學檢測均與不同參數(shù)(T2-，T1-，diffusion- and perfusion-weighted imaging)得到的數(shù)據(jù)相一致。 結論：應用多參數(shù)MR影像學對局灶性腦缺血再灌注模型進行動態(tài)評價，從而明確缺血再灌注時間和組織特征性，為進一步研究腦缺血

6、的診斷和治療奠定基礎。 第三部分：NGF/VEGF基因治療局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時間窗及MR影像學評價 實驗一：NGF對兔局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時間窗及MR影像學評價 目的：研究神經(jīng)生長因子(NGF)對腦缺血再灌注損傷保護作用的有效時間窗，同時利用先進的MR成像技術進行評價。 方法：采用兔大腦中動脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，分別在缺血2h再灌注損傷后0h、1h、3h和6h應用微量

7、進樣器將NGF立體定向導入梗死灶周，于再灌注72h，應用MR影像學、分子生物學、流式細胞學觀察梗死體積、水腫體積、神經(jīng)功能缺損、灶周凋亡率、表觀彌散系數(shù)比值(ADCR)和caspase-3蛋白表達。 結果：缺血再灌注0h、1h、3h灶周給予NGF，梗死體積分別比對照組下降50.1％、48.4％、37.6％，相應的灶周凋亡率及caspase-3 含量明顯下降，灶周ADCR升高；再灌注6h后給藥，則無明顯作用。相關分析顯示梗死體積及

8、ADCR的變化與caspase-3蛋白表達下降程度明顯相關。 結論：NGF對兔局灶性腦缺血再灌注損傷的有效時間窗在再灌注損傷3h內，灶周缺血半暗帶caspase-3 蛋白表達與治療時間窗有關，NGF可通過減少caspase-3 蛋白的表達減少腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的發(fā)生。 實驗二：VEGF治療局灶性腦缺血再灌注損傷的量效關系和神經(jīng)保護治療時間窗 目的：探討血管內皮細胞生長因子(VEGF)對家兔局灶性腦缺血再灌注

9、損傷的量．效治療關系和有效神經(jīng)保護治療時間窗。 方法：采用兔大腦中動脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，在缺血2h再灌注損傷后即刻應用微量進樣器將不同劑量的VEGF165(1-25ng/μL，2.5ng/μL，5.0ng/μL)立體定向導入梗死灶周，并選擇最適劑量，將給藥時間延遲至1h，3h，6h，12h，于再灌注72h，觀察梗死體積、灶周缺血半暗帶caspase-3蛋白表達、凋亡率、ADC值比率(ADCR)，評價神經(jīng)功能

10、缺損。 結論：2.5ng/μL INEGF 應用治療家兔局灶性腦缺血再灌注損傷可誘導血管發(fā)生和神經(jīng)保護作用，是進一步研究和評價 VEGF 治療效應的最佳劑量。VEGF 對兔局灶性腦缺血再灌注損傷的有效治療時間窗在再灌注損傷1h內。 實驗三：NGF 和VEGF 聯(lián)合應用拓寬局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護治療時間窗 目的：觀察神經(jīng)生長因子(NGF)和血管內皮生長因子(VEGF)對兔局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用

11、，并探討其發(fā)生機制。 方法：34只雄性4.5-5 月齡新西蘭白兔隨機數(shù)字表法分為假手術組(n=6)、生理鹽水組(n=8)，再灌注3h因子治療組(n=10)和再灌注6h因子治療組(n=10)。采用兔大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血再灌注模型，假手術組線栓插入的深度不同。因子治療組在缺血2h再灌注損傷后3 h和6 h應用微量進樣器將2.5ng/μL VEGF165和NGF400AU(相當于16μg/L)50μL 立體定向導入梗死灶周，生理

12、鹽水組則注入同等劑量的生理鹽水，于再灌注72h，應用MR影像學、TTC染色和流式細胞術評價各組動物腦梗死體積、灶周缺血半暗帶細胞凋亡率、ADCR及caspase-3 活性表達。在大腦中動脈阻塞2 h再灌注后24 h、72 h采用Purdy評分標準行神經(jīng)功能缺損評分。 第四部分：細胞外信號調節(jié)激酶在NGF/VEGF 介導的神經(jīng)保護作用中的動態(tài)變化及其調控機制 目的：探討細胞外信號調節(jié)激酶(estracellular sig

13、nal-regulated kinase，ERK)在局灶性腦缺血/再灌注不同時間、不同腦區(qū)的動態(tài)時空變化，以及其在NGF/VEGF介導的神經(jīng)保護作用中的調控表達機制。 方法：采用兔大腦中動脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，應用免疫組化檢測ERK1在腦缺血2h再灌注不同時間海馬和皮層的動態(tài)表達規(guī)律，同時，應用免疫組化和流式細胞術檢測caspase-3 和凋亡狀態(tài)的動態(tài)變化，以及其在NGF/VEGF介導的神經(jīng)保護作用中的表達

14、。 結論：ERK 信號通路通過控制海馬和灶周皮層死亡受體途徑介導神經(jīng)保護作用，抑制ERK 信號途徑可能是預防缺血損傷過程中神經(jīng)細胞死亡的有效方法。 第五部分：急性腦心綜合征動物模型的建立及意義的初步探討 在前期實驗中，我們在X線透視引導下，應用導絲阻斷大腦中動脈，從而建立了穩(wěn)定可控重復性好的局灶性腦缺血再灌注模型。同時我們在實驗中發(fā)現(xiàn)體重3.5-4.0kg、月齡5-6 月的家兔在造模時，于再灌注4-6h和24-3