依布硒啉對丁胺卡那霉素致豚鼠耳蝸毒性保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：氨基糖甙類抗生素在臨床應(yīng)用時會引起嚴(yán)重的耳毒性副作用，研究證實(shí)：活性氧物質(zhì)的大量形成導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷。依布硒啉(ebselen)是谷胱甘肽過氧化物酶的模擬物，可有效清除活性氧物質(zhì)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)建立豚鼠丁胺卡那霉素耳蝸毒性模型，給予ebselen作為保護(hù)劑，通過血清酶學(xué)檢測，畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢查，耳蝸毛細(xì)胞光鏡、透射電鏡和掃描電鏡觀察，探討氨基糖甙類藥物對機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響，以及ebselen對丁胺卡那霉素致豚

2、鼠耳蝸毒性的保護(hù)機(jī)制和效果，從而為預(yù)防氨基糖甙類藥物的耳毒性探索出一條可行之路。 材料與方法：L實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動物取耳廓反射正常，健康雄性白色紅目豚鼠24只。實(shí)驗(yàn)試劑為丁胺卡那霉素(Amikacin)，依布硒啉(ebselen)，購自比利時AcrosOrganics公司。血清學(xué)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)儀器OlympusBX-51熒光顯微鏡照像成像系統(tǒng)，JEOL公司JSM-T300掃描電子顯微鏡，JEM-1200E

3、X透射電子顯微鏡，美國IHC公司LB563-EA型耳聲發(fā)射分析測試系統(tǒng)。 2.實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)分組及處理，24只豚鼠隨機(jī)分成對照組、丁胺卡那霉素組、丁胺卡那霉素+ebselen組，每組8只。丁胺卡那霉素組：丁胺卡那霉素，400mg/kg/d，肌肉注射；丁胺卡那霉素+ebselen組：ebselen30mg/kg/d肌肉注射，30分鐘后，予丁胺卡那霉素，400mg/kg/d，肌肉注射；對照組：生理鹽水等量肌肉注射。連續(xù)7天。首次用藥

4、前一天，末次用藥后一天行雙耳畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢測(distortionproductotoacousticemission，DPOAE)，豚鼠處于麻醉狀態(tài)，選擇初始純音f和f2，f2/f1=1.22，強(qiáng)度差L1-L2=10dBSPL，取2f1-f2處幅值超過本底噪聲3dB為檢出標(biāo)準(zhǔn)。測試頻率f0[f0=(f1×f2)1/2]為0.5、1、2、4、8kHz處的幅值。檢測結(jié)束后取眼內(nèi)眥血行血清總超氧化物歧化酶(totalsuperoxide

5、disumutase，T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-PX)、丙二醛(malondialdhyde，MDA)檢測；采血后取耳蝸，左耳蝸基底膜鋪片光鏡觀察，右耳蝸掃描電鏡及毛細(xì)胞透射電鏡觀察。豚鼠麻醉狀態(tài)下，先以4℃生理鹽水經(jīng)心臟灌流，再以4℃4％多聚甲醛與2.5％戊二醛的磷酸鹽緩沖液灌流，取左側(cè)耳蝸，從蝸尖灌注0.5％硝酸銀溶液后，再用4％多聚甲醛溶液灌注并固定于該溶液中4小時，取全

6、程基底膜，分回封片，自然光下曝光，光鏡觀察。取右側(cè)耳蝸，每組4只行掃描電鏡觀察，4只行透射電鏡觀察，4℃2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液行耳蝸灌流，固定于該溶液中4小時后，透射電鏡組：取全程基底膜，常規(guī)制備透射電鏡標(biāo)本，超薄切片，透射電鏡觀察。掃描電鏡組：揭除蓋膜，暴露基底膜；常規(guī)制備掃描電鏡標(biāo)本，干燥鍍膜，掃描電鏡觀察。全部數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS11.5軟件統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以-X±S表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較

7、采用單因素方差分析。以p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果：1.DPOAE幅值檢測丁胺卡那霉素組用藥后DPOAE幅值在1、2、4、8kHz較用藥前明顯下降(p＜0.01)，而且明顯低于丁胺卡那霉素+ebselen組和對照組用藥后在相應(yīng)頻率處幅值(p＜0.01)。丁胺卡那霉素+ebselen組用藥后DPOAE幅值在2、4、8kHz較用藥前下降，而且較對照組用藥后相應(yīng)頻率處的幅值下降，有顯著差異(p＜0.01)。 2.血清T-

8、SOD、GSH-PX活性，MDA含量檢測用藥7天后丁胺卡那霉素組和丁胺卡那霉素+ebselen組T-SOD及GSH-PX活性值較對照組顯著下降，MDA含量值較對照組顯著升高(p＜0.01)。同時，丁胺卡那霉素組T-SOD、GSH-PX活性低于丁胺卡那霉素+ebselen組，而MDA含量高于丁胺卡那霉素+ebselen組(p＜0.01)。 3.耳蝸基底膜鋪片光鏡觀察丁胺卡那霉素組：大部分外毛細(xì)胞纖毛缺損，排列不齊，細(xì)胞有多處散在空

9、位。內(nèi)毛細(xì)胞個別腫脹。丁胺卡那霉素+ebselen組：大部分外毛細(xì)胞纖毛正常，少許缺損消失，損傷的毛細(xì)胞主要集中在第一排外毛細(xì)胞。內(nèi)毛細(xì)胞基本正常。對照組：內(nèi)外毛細(xì)胞基本正常，纖毛清晰，排列整齊，細(xì)胞間隔均勻。 4.耳蝸基底膜掃描電鏡觀察丁胺卡那霉素組：大部分外毛細(xì)胞出現(xiàn)纖毛粘連倒伏，丟失，伴隨表皮板萎縮崩解。內(nèi)毛細(xì)胞也出現(xiàn)纖毛倒伏紊亂。丁胺卡那霉素+ebselen組：僅第一排外毛細(xì)胞纖毛有粘連、部分缺失，表皮板平坦完整。內(nèi)毛細(xì)

10、胞纖毛排列整齊。對照組內(nèi)外毛細(xì)胞纖毛排列整齊，形態(tài)正常。 5.外毛細(xì)胞透射電鏡觀察丁胺卡那霉素組：外毛細(xì)胞細(xì)胞核核膜內(nèi)陷皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，邊緣化，線粒體空泡樣變性，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)水腫及空泡形成。丁胺卡那霉素+ebselen組：外毛細(xì)胞細(xì)胞核正常，線粒體無空泡變性，胞漿內(nèi)少許空泡形成。對照組外毛細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)散在，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無腫脹，胞漿內(nèi)無空泡。 討論：臨床應(yīng)用氨基糖甙類藥物引起耳蝸毛細(xì)胞不可逆損傷，主要是活性

11、氧物質(zhì)(reactiveoxygenspecies，ROS)的氧化損傷機(jī)制。生物體內(nèi)包括耳蝸組織存在著活性氧物質(zhì)清除系統(tǒng)，即抗氧化系統(tǒng)。包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等酶群，以及非酶類物質(zhì)，如脂維生素E、維生素C、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等。它們協(xié)同作用，清除機(jī)體內(nèi)的ROS。氨基糖甙類藥物造成ROS大量生成，消耗機(jī)體抗氧化物質(zhì)，造成氧化還原系統(tǒng)的失衡。積聚的ROS與毛細(xì)胞胞膜上的不飽和脂肪酸RH發(fā)生

12、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成大量脂質(zhì)過氧化物，被斷裂成丙二醛等，影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，形成Ca2+內(nèi)流，引起胞內(nèi)構(gòu)架的破壞，核DNA的碎解，造成耳蝸毛細(xì)胞的不可逆損傷。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用丁胺卡那霉素后，豚鼠血清中T-SOD、GSH-PX活性明顯低于對照組，MDA含量則明顯增高(p＜0.01)。證明了丁胺卡那霉素誘發(fā)的ROS消耗并破壞機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化能力下降，引起了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。 DPOAE反映耳蝸外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)。丁

13、胺卡那霉素組用藥7天后，幅值在1、2、4、8kHz處較用藥前明顯下降，并且與對照組用藥后相比有顯著差異(p＜0.01)。表明丁胺卡那霉素?fù)p傷了豚鼠耳蝸的外毛細(xì)胞功能，并且高頻聽力區(qū)損傷較重?；啄や伷忡R觀察和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大部分外毛細(xì)胞纖毛損傷，從頂回至底回逐漸加重。內(nèi)毛細(xì)胞損傷相對較輕。這種現(xiàn)象可能與內(nèi)源性自由基清除劑GSH在耳蝸底回的分布濃度低于蝸尖部，同時底回外毛細(xì)胞的易損性高于頂回部分有關(guān)，因此底回更容易受到氧化損傷。外毛

14、細(xì)胞的透射電鏡觀察證實(shí)丁胺卡那霉素不僅使毛細(xì)胞表面纖毛受損，其內(nèi)部細(xì)胞器以及核DNA亦受到損傷，這被認(rèn)為是毛細(xì)胞凋亡的誘因和表現(xiàn)。 補(bǔ)充機(jī)體抗氧化系統(tǒng)成分，提高抗氧化能力，已經(jīng)被證明是一種有效的防止氨基糖甙類藥物耳蝸毒性的方法。本實(shí)驗(yàn)所研究的依布硒啉(ebselen)是GSH-PX的良好模擬物，能清除機(jī)體內(nèi)過多的ROS，增強(qiáng)組織中的抗氧化能力。ebselen抗氧化機(jī)制主要體現(xiàn)為擬谷胱甘肽過氧化物酶活性，可以直接還原過氧化氫H2O

15、2和脂質(zhì)過氧化物ROOH，還與GSH和其他硫基化合物(-SH)協(xié)同作用，形成苯并硒二唑和聯(lián)硒化物，具有強(qiáng)大的過氧化氫還原酶活性。Ebselen也可以清除過氧化亞硝酸鹽ON00-。Ebselen還可抑制病理?xiàng)l件下的細(xì)胞凋亡，減少了線粒體的破壞及細(xì)胞凋亡因子-細(xì)胞色素C的釋放，以及DNA碎片的產(chǎn)生。 丁胺卡那霉素應(yīng)用前給予ebselen作為保護(hù)劑，該組豚鼠血清中T-SOD、GSH-PX活性較丁胺卡那霉素組得到了明顯的提高，同時MDA

16、含量顯著降低(p＜0.01)，說明了ebselen可以減輕丁胺卡那霉素造成的機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡，并減輕脂質(zhì)過氧化損傷的程度。在DPOAE檢測結(jié)果中，丁胺卡那霉素+ebselen組用藥后，在2、4、8kHz頻率處的幅值低于對照組用藥后相應(yīng)頻率處幅值，但幅值的下降程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于丁胺卡那霉素組的下降程度(p＜0.01)，證明了ebselen減輕了高頻區(qū)域的外毛細(xì)胞損傷程度，起到了一定的保護(hù)作用。丁胺卡那霉素+ebselen組的基底膜光鏡觀察和

17、耳蝸掃描電鏡觀察到的結(jié)果一致，表現(xiàn)為大部分外毛細(xì)胞纖毛正常，少許外毛細(xì)胞的纖毛粘連、缺損，主要集中在第一排外毛細(xì)胞，內(nèi)毛細(xì)胞基本正常。透射電鏡觀察到外毛細(xì)胞核形態(tài)大致正常，核內(nèi)染色質(zhì)散在，線粒體無空泡變性改變，僅胞漿內(nèi)少許空泡形成。這些與丁胺卡那霉素組鏡下表現(xiàn)相比，損傷程度明顯減輕。證明了ebselen可以有效清除機(jī)體內(nèi)ROS，維持抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定，減輕了氨基糖甙類藥物的耳蝸毒性。Ebselen還被證實(shí)可以減輕噪聲誘導(dǎo)的聽力損傷和順鉑所