枸杞子提取物在病理模型中的探索性研究.pdf

1、枸杞子是茄科植物寧夏枸杞的成熟干燥果實，為我國常用中藥。枸杞成分復(fù)雜，本實驗采用化學(xué)成分明確的枸杞子提取液LBA及枸杞多糖LBP，在常見臨床病理模型:視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜神經(jīng)變性RCS大鼠及糖尿病胃癱模型中，探索其藥理學(xué)作用，為枸杞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和新藥思路。
　　第一部分、枸杞子提取液在視網(wǎng)膜缺血模型中的研究
　　目的:觀察枸杞子提取液(LBA)對視網(wǎng)膜缺血的防治作用并探索其與細胞凋亡的相關(guān)聯(lián)系。
　　材料與方法

2、:建立前房加壓誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜缺血模型，將36只雄性Wistar大鼠隨機分組，正常組4只，生理鹽水組（NS組）16只，LBA組16只。LBA組及NS組于模型制作前28天分別連續(xù)經(jīng)口喂食LBA(1 mg/kg)及等量生理鹽水(NS)，LBA組及NS組根據(jù)灌注時間的不同，再分為灌注后12h、24h、48h及72h四組。采用HE染色和TUNEL法檢測，觀察LBA組及NS組視網(wǎng)膜中各層神經(jīng)元的變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Fas/FasL蛋白的

3、表達探索其與細胞凋亡的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　(1)HE染色:NS組大鼠內(nèi)核層缺血再灌注12小時之后厚度輕微變薄，細胞數(shù)略微減少，此時內(nèi)網(wǎng)層、外網(wǎng)層及外核層變化不大。24小時后，外網(wǎng)層變薄，外核層變化輕微，內(nèi)核層結(jié)構(gòu)層次紊亂，視網(wǎng)膜以節(jié)細胞數(shù)減少最為顯著。48小時后，各層厚度變薄程度逐漸更加明顯，以內(nèi)核層最為顯著，細胞數(shù)大量減少。72小時后，各層細胞進一步變薄。與NS組相比，不同時間點LBA組大鼠內(nèi)核層至內(nèi)界膜厚度，均超過N

4、S組(P＜0.01)，內(nèi)核層細胞數(shù)和節(jié)細胞數(shù)比NS組多，細胞形態(tài)及排列也比較規(guī)整。
　　(2) TUNEL檢測:正常鼠無細胞凋亡表現(xiàn)，TUNEL染色呈陰性反應(yīng)。12小時后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細胞層均可觀察到TUNEL陽性細胞，到24hTUNEL陽性細胞明顯增多，內(nèi)核層最為明顯，而外核層無明顯的細胞凋亡征象。24h開始TUNEL陽性細胞逐漸減少，到72h時凋亡細胞只有3～6個/100μm。LBA組TUNEL陽性細胞表達規(guī)律與鹽

5、水對照組類似，TUNEL陽性細胞在12、24、48h比生理鹽水組有顯著減少。
　　(3) Fas/FasL染色:正常鼠不表達Fas/FasL陽性細胞。12小時后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細胞層均可觀察到Fas的少量表達;到24h后Fas陽性細胞明顯增多，內(nèi)核層最為明顯。到72h后Fas陽性細數(shù)明顯減少。LBA組Fas陽性細胞表達規(guī)律與鹽水對照組類似，F(xiàn)as陽性細胞細胞在各個時間段比生理鹽水組均有顯著減少。FasL的表達表達規(guī)律早期

6、與Fas及TUNEL染色表達規(guī)律均相似，12小時后生理鹽水組內(nèi)核層與視網(wǎng)膜節(jié)細胞層均可觀察到FasL的少量表達，24h后FasL陽性細胞明顯增多，達到高峰，以后逐漸下降但72h后仍維持高表達。LBA組FasL陽性細胞數(shù)在各個時間段比生理鹽水組均有顯著減少。
　　結(jié)論:
　　(1)視網(wǎng)膜缺血模型前28天連續(xù)經(jīng)口喂食LBA1 mg/kg，可以有效保護大鼠視網(wǎng)膜，內(nèi)核層變薄程度顯著降低，各層細胞數(shù)比對照組也顯著增加。
　　(

7、2)細胞凋亡是導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷原因之一，大鼠經(jīng)口喂食LBA可以顯著降低此類凋亡。
　　(3) Fas/FasL凋亡信號系統(tǒng)的參與是造成視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷的機理之一，LBA通過有效降低Fas/FasL陽性細胞數(shù)，達到保護視網(wǎng)膜缺血損傷的作用。
　　第二部分、枸杞子提取液對RCS大鼠視網(wǎng)膜的探索性研究
　　目的:觀察枸杞子提取液(LBA)對RCS大鼠視網(wǎng)膜色素變性的治療作用。
　　方法:RCS大鼠60只，隨機分

8、為給藥組和對照組各30只。給藥組大鼠出生后第10天開始喂食LBA(1 mg/kg)，對照組大鼠喂食等量生理鹽水。兩組大鼠分別在生后25、35、50d處死，取出眼球，制備組織切片，HE染色和TUNEL檢測視網(wǎng)膜感光細胞的數(shù)量，Caspase-2染色檢測LBA對細胞凋亡的作用。
　　結(jié)果:給藥組大鼠出生25d時，感光細胞數(shù)目比對照組細胞數(shù)目多;35d時，感光細胞數(shù)目較25d時有所下降;50d時感光細胞數(shù)目與對照組比較無明顯差異。LBA

9、組在第25天陽性感光細胞明顯多于對照組。RCS大鼠給藥組25d時TUNEL檢測陽性細胞數(shù)目與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RCS大鼠LBA組在25天和35天時Caspase-2陽性細胞主要分布于內(nèi)核層及節(jié)細胞層，實驗組第25天陽性細胞數(shù)為7.14±1.86，明顯低于對照組(P＜0.05)，之后兩組差別逐漸變小，到第50天，兩組的陽性細胞數(shù)差別不大。
　　結(jié)論:在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性的早期，LBA可以使感光細

10、胞得到更多存留，對早期變性的神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。LBA對凋亡的抑制作用可能與抑制Caspase-2蛋白表達有關(guān)。
　　第三部分、LBP對大鼠糖尿病胃癱模型血糖及胃動力研究
　　目的:本實驗采用枸杞多糖(LBP)對糖尿病大鼠模型并發(fā)癥胃癱進行探索性研究，希冀為糖尿病胃癱的臨床治療提供依據(jù)和新的治療方法。
　　材料與方法:本實驗中，LBP的口服劑量分為三組，每天100，200 and400 mg/kg，實驗前提前連續(xù)喂食2

11、8天后，建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠病理模型，測量血液中葡萄糖、胰島素含量及胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、Ghrelin、Ghrelin mRNA、胃排空率、凋亡指數(shù)(AI)及Bcl-2/Bax比值，并進行相應(yīng)的分析。
　　結(jié)果:LBP顯著降低葡萄糖、胰島素及IRI水平(P＜0.05)。Ghrelin在LBP給藥后顯著升高，呈劑量依賴性(P＜0.05)。糖尿病大鼠Ghrelin mRNA在胃粘膜表達增加，但在LBP給藥后顯著降低(P