西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前體基因的克隆、生物信息學(xué)分析及真核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本研究參照GenBank收錄的綿羊凝乳酶原前體cDNA序列(GenBank No：X53037)設(shè)計(jì)RT-PCR、PCR與巢式引物，以新生5天的西農(nóng)薩能羊公羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用手術(shù)法采集羔羊皺胃組織，利用Trizol法提取皺胃組織總RNA，經(jīng)過(guò)電泳鑒定后，以總RNA為模板利用RT-PCR方法獲得西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前體cDNA序列，以cDNA序列為模板進(jìn)行擴(kuò)增和T載體連接測(cè)序。利用軟件NCBI BLASTn、BLASTp與ClustalW

2、對(duì)該基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)分析；利用軟件Compute pI/MW、MLRC、SignalP V3.0分別分析該基因的物理性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)與折疊類型、信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；利用軟件Feature Map3D、SWISS-MODE分析該基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)與活性中心位點(diǎn)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，利用酵母整合質(zhì)粒載體pPICZα A構(gòu)建重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒整合至巴斯德畢赤酵母基因組DNA，篩選鑒定凝乳酶原重組轉(zhuǎn)化子。獲得以下研究結(jié)果：

3、 1.克隆了西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前體基因Cdna序列，全長(zhǎng)1292bp，編碼381個(gè)氨基酸，該基因Cdna序列登錄GenBank(GenBank No：EFl99763)。序列分析表明，西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前體基因與山羊、牛、綿羊、狷羚、駱駝、狗、人、豬、恒河猴、兔子凝乳酶原的核苷酸同源性分別為99.41％、98.74％、95.29％、95.81％、87.48％、83.69％、81.91％、67.43％、66.74％、66.39％，

4、氨基酸同源性分別為99.21％、98.42％、93.70％、93.42％、83.99％、74.09％、57.22％、56.37％、57.18％、54.18％。 2.物理性質(zhì)分析表明，西農(nóng)薩能羊凝乳酶原的分子量為大約為42.1kDa，成熟凝乳酶的分子量為35.5kDa，等電點(diǎn)為4.45。 3.通過(guò)對(duì)凝乳酶原前體基因二級(jí)結(jié)構(gòu)與折疊類型的分析表明，α螺旋短片段約占總氨基酸的8.36％，β折疊約占總氨基酸的32.82％，α螺旋短

5、片在1-175氨基酸殘基組成的N端區(qū)域和176-323氨基酸殘基組成的C端區(qū)域無(wú)相同的片段。 4.凝乳酶原前體蛋白存在一個(gè)16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分析表明，西農(nóng)薩能羊凝乳酶原基因的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于，Met16-Gly17之間。 5.三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明：本研究克隆出的凝乳酶原前體基因形成的成熟凝乳酶在244位點(diǎn)為甘氨酸，為B型凝乳酶。兩個(gè)天冬氨基酸活性位點(diǎn)：Asp32和Asp215，維持活性中心三維構(gòu)象的氨

6、基酸Thr33、Ser35、Thr216、Thr218、NHGly217和NHGly34，二硫鍵：Cys45-Cys50，Cys206-Cys210和Cys250-Cys283均無(wú)變異，能夠形成正確的二裂片三維構(gòu)象。 6．利用設(shè)計(jì)的引物和酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA成功構(gòu)建了西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前體基因的非融合蛋白和融合蛋白重組表達(dá)載體Ppicz—T1、Ppicz—T2，電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母后，成功將重組西農(nóng)薩能羊凝乳酶原前