CUL4A在肝細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌，HepatocellularCarcinoma，HCC)是我國最常見的高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是由體內(nèi)多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過程。外科手術(shù)切除是HCC最為有效的治療方法之一，但是絕大多數(shù)HCC患者就診時已有肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、血管侵犯，或因肝臟儲備能力差，不能進(jìn)行手術(shù)治療，且目前又缺乏較為有效的非手術(shù)治療方法，造成HCC患者預(yù)后差。因此，為了改變HCC患者預(yù)后差的現(xiàn)狀，迫切需要對HCC

2、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入研究，識別新的分子靶點，開發(fā)出新的靶向藥物。
　　 泛素化作為蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控的重要途徑，已被證明與蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切關(guān)聯(lián)，而E3連接酶作為泛素化過程中最具復(fù)雜性、多樣性的環(huán)節(jié)，已成為國內(nèi)外的腫瘤專家研究熱點，特別是與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的Cullins家族、泛素化降解腫瘤抑制基因p53相關(guān)的RING家族.泛素化分子CUL4A就是在癌基因高表達(dá)區(qū)域(13q34染色體)擴(kuò)增的靶基因之一，并在原

3、發(fā)性肝癌中穩(wěn)定擴(kuò)增。CUL4A通過MDM2參與P53調(diào)節(jié)，表達(dá)升高時促進(jìn)了P53的降解，從而促進(jìn)了肝癌的發(fā)生。在肝細(xì)胞癌(HCC)中也存在基因組水平的穩(wěn)定擴(kuò)增，但其在HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體作用及機(jī)制尚未明確。
　　 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial.mesenchymaltransition，EMT)，是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。目前，EMT被看成導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展重要的病理過程，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移

4、有關(guān)系。在EMT的過程中，細(xì)胞之間的粘附減少，上皮細(xì)胞極性喪失，與周圍基質(zhì)細(xì)胞的接觸減少，細(xì)胞遷移和運動能力增強(qiáng)，同時細(xì)胞表型發(fā)生改變，喪失上皮表型，如β-連環(huán)素(β-catenin)、E-鈣粘素(E-cadherin)，而獲得間質(zhì)表型，如波形蛋白(Vimetmin)，纖維連接蛋白，N-鈣粘素(N-cadherin)，a-SMA等。其中E-cadherin水平的下降可以導(dǎo)致細(xì)胞的粘附力降低，使細(xì)胞獲得易于侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，E-cadhe

5、rin表達(dá)的丟失已經(jīng)被認(rèn)為是EMT最顯著的特征。在肝細(xì)胞癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，P28、CHDL1、CyclinG1等多種肝癌相關(guān)分子能夠通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而大大提高肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，CULAA表達(dá)量增高后，細(xì)胞間粘附性明顯減弱，細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，侵襲性增強(qiáng)。從體外(穩(wěn)定過表達(dá)和干擾肝癌細(xì)胞系)和體內(nèi)(裸鼠荷瘤實驗)兩方面驗證，CUL4A與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力相關(guān)。
　　 Huber等的研究

6、表明Ras引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，NF-κB對EMT的發(fā)生具有關(guān)鍵作用。抑制NF-κB活性可促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并有效抑制EMT的發(fā)生；而持續(xù)的NF-κB通路激活能起到維持EMT的作用。NF-κB信號通路激活包括經(jīng)典激活途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑是指IκBa蛋白降解而暴露出NF-κB/p65亞單位上的核轉(zhuǎn)位信號，使得NF-κB進(jìn)入核內(nèi)并與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因的增強(qiáng)子區(qū)相結(jié)合，從而啟動這些基因的轉(zhuǎn)錄過程。我們研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染熒光素酶

7、報告基因法，檢測未加處理狀況下和加入TNFa激活NF-kB后，CUL4A表達(dá)量增高會明顯激活NF-kB信號通路。為進(jìn)一步驗證CUL4A對NF-kB信號通路的影響，我們進(jìn)行了以下實驗：RT-PCR和Westernblot實驗，提示CUL4A表達(dá)量增高后，IkBa表達(dá)量降低，P65含量增高；通過免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)CUL4A與P65的表達(dá)情況成正比；免疫細(xì)胞熒光實驗，提示過表達(dá)CUL4A后對P65表達(dá)水平明顯增加并且有明顯的核定位情況；免疫共

8、沉淀實驗，過表達(dá)CUL4A使IkBa泛素化降解明顯增加。實驗結(jié)果驗證了，CUL4A通過泛素化降解IkBa，激活NF-κB信號通路，從而促進(jìn)了肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
　　 實驗研究表明，CUL4A通過調(diào)控NF-κB-EMT信號通路進(jìn)而影響肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移。CUL4A在肝癌分子分型和預(yù)后分析中的價值提供理論依據(jù)，并將為肝癌的靶向治療提供潛在的分子干預(yù)靶點。
　　 [實驗方法]
　　 1.檢測CUL4A在人肝細(xì)胞癌組織和肝癌

9、細(xì)胞系中的表達(dá)情況并分析與HCC患者病例資料聯(lián)系；
　　 2.構(gòu)建過表達(dá)和干擾CUL4A的質(zhì)粒，并建立穩(wěn)定的過表達(dá)CUL4A和干擾的肝癌細(xì)胞系；
　　 3.PLC-CUL4A及對照細(xì)胞分別采用CCK-8法、細(xì)胞周期檢測、劃痕實驗、Transwell、侵襲實驗、克隆形成實驗等方法觀察過表達(dá)CUL4A對肝癌細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲、惡性轉(zhuǎn)化等生物學(xué)特性的影響；
　　 4.LM3-siCUL4A及對照細(xì)胞分別采用CCK-

10、8法、細(xì)胞周期檢測、劃痕實驗、Transwell、侵襲實驗、克隆形成實驗等方法觀察干擾CUL4A表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、惡性轉(zhuǎn)化等生物學(xué)特性的影響；
　　 5.將LM3-siCUL4A及對照細(xì)胞分別以裸鼠皮下注射方式注射到裸鼠體內(nèi)，觀察干擾CULAA對肝癌細(xì)胞在裸鼠中成瘤能力影響；
　　 6.通過qRT-PCR、westernblotting、免疫細(xì)胞熒光等方法檢測過表達(dá)或干擾CUL4A對EMT相指標(biāo)(E-cad

11、herin、β-catenin、N-cadherin、Snail和Vimentin)的影響；
　　 7.運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測過表達(dá)CUL4A對NF-kB信號通路的影響；瞬時轉(zhuǎn)染干擾CUL4A表達(dá)的質(zhì)粒，反向觀察CUL4A表達(dá)降低對NF-kB信號通路的影響；
　　 8.運用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，檢測未加處理狀況下和加入TNFa激活NF-kB后，CUL4A對P65等轉(zhuǎn)錄活性的影響；
　　 9.用qRT-PC

12、R和Westernblotting法檢測過表達(dá)或干擾CUL4A表達(dá)對IkBa的影響；
　　 10.用Westernblotting和免疫共沉淀等方法檢測過表達(dá)CUL4A表達(dá)對IkBa泛素化降解影響。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1.從qRT-PCR和westernblotting水平證實CUL4A在肝細(xì)胞癌中異常高表達(dá)(80％以上的HCC患者中癌組織CUL4A蛋白表達(dá)高于癌旁)，提示CUL4A可能與肝癌的發(fā)生相關(guān)。

13、
　　 2.通過免疫組化實驗，統(tǒng)計分析得出高表達(dá)CUL4A與腫瘤侵襲性表型(高AFP水平、無腫瘤包膜、低分化程度、病理癌栓、血管侵犯、高TNM分期)相關(guān)。
　　 3.構(gòu)建全長CUL4A真核表達(dá)質(zhì)粒，建立穩(wěn)定過表達(dá)CUL4A的肝癌細(xì)胞系和對照細(xì)胞系。同時通過增殖、劃痕、transwell實驗，驗證CUL4A表達(dá)量升高后肝癌細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)，惡性程度也明顯升高。
　　 4.構(gòu)建CUL4A干擾質(zhì)粒，建

14、立穩(wěn)定干擾CUL4A的肝癌細(xì)胞系和對照細(xì)胞系。同時通過增殖、劃痕、transwell和流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)了CUL4A表達(dá)量降低后肝癌細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲能力明顯減弱，惡性程度也明顯降低。
　　 5.通過皮下荷瘤實驗，注射干擾CUL4A和對照肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)CUL4A表達(dá)量降低后，裸鼠中皮下成瘤能力明顯降低。
　　 6.qRT-PCR，westernblotting和細(xì)胞免疫熒光等實驗表明，過表達(dá)CUL4A后肝癌細(xì)胞表

15、皮的標(biāo)志物表達(dá)明顯降低，間充質(zhì)的標(biāo)志物表達(dá)明顯升高；干擾肝癌細(xì)胞系中CUL4A的表達(dá)，則導(dǎo)致表皮的標(biāo)志物明顯升高，間充質(zhì)的標(biāo)志物明顯降低。
　　 7.雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測表明，過表達(dá)CUL4A會激活NF-κB信號通路；干擾CUL4A表達(dá)則抑制NF-κB信號通路活性。
　　 8.細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，CUL4A過表達(dá)后，TNFa刺激引起的P65富集和入核更明顯。
　　 9.Westernblotting實

16、驗，過表達(dá)CUL4A導(dǎo)致IkBa含量降低；干擾CUL4A表達(dá)會使IkBa含量增加。
　　 10.Westernblotting和免疫共沉淀等方法表明，過表達(dá)CUL4A能促進(jìn)IkBa的泛素化降解。
　　 [結(jié)論]：
　　 CUL4A在80%以上的肝細(xì)胞癌中異常高表達(dá)，且高表達(dá)CUL4A與腫瘤侵襲性表型相關(guān)。肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)CUL4A能使肝癌細(xì)胞上皮標(biāo)志物(E-cadherin，β-catenin)表達(dá)量降低，間質(zhì)

17、標(biāo)志物(N-cadherin，vimentin，snail，fibronectin)表達(dá)量增高，并且能提高肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。裸鼠皮下荷瘤實驗表明，降低CUL4A表達(dá)使肝癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯降低。機(jī)制方面，CUL4A過表達(dá)導(dǎo)致IkBa表達(dá)量降低，P65含量增高，從而激活NF-κB信號通路。進(jìn)一步的免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，CUL4A過表達(dá)促進(jìn)了IkBa的泛素化降解。研究提示，CUL4A可能通過促進(jìn)IkBa泛素化降解，激活NF